陈龙，付王艳，方琼燕，唐果，刘论，向松涛

(1.新希望乳业股份有限公司，成都 610023；2.四川新希望畜牧科技有限公司，成都 610042；3.乳品营养与功能四川省重点实验室，成都 610023)

0 引 言

牛乳营养丰富，食用便利，富含优质的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素和微量元素，牛乳中的蛋白质含有人体所需的全部必需氨基酸，消化率可达98%～100%，因此被认为是自然界最接近完美的食品。乳蛋白是牛乳中最主要和最有营养价值的成分，其含量约占牛乳的3.0%～3.6%，主要以酪蛋白和乳清蛋白为主，还有少量的酶类。酪蛋白是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、γ-酪蛋白等多种蛋白质组成的混合物，总含量约占乳蛋白的80%。β-酪蛋白目前已鉴定出至少有13种变体，其中A1和A2型是最常见的两种类型。A1型β-酪蛋白在人体消化道中经过酶解可产生β-酪啡肽-7(Beta-casomorphin-7，BCM-7)，可以被直接吸收，与人体多个生理系统相互作用，推测其可能与1型糖尿病、心血管疾病、自闭症、精神分裂症、消化功能紊乱等慢性非传染性疾病的发生有密切关系，但目前动物及人体相关试验在这方面仍然还没有定论。本文阐述了β-酪蛋白的基因多态性及分型方法、BCM-7的生成机制及其对人体健康的潜在影响，为β-酪蛋白及A2型牛乳在乳制品行业的研究与开发提供一定的理论参考。

1 β-酪蛋白基因和分型

1.1 β-酪蛋白基因变异类型

β-酪蛋白由牛基因组的第6号染色体编码209个氨基酸组成，分子量为23983[1]。迄今为止已发现了13种遗传变体，分别为A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G、H 1、H 2和I，其中A4变体在韩国本地牛中发现，但未经确认，每个变体根据肽链特定点位氨基酸的不同相区分[2]。在牛乳中，β-酪蛋白最常见的类型是A1型和A2型，其他类型很少见，A2型β-酪蛋白是最原始的类型，是定义其他类型的参考蛋白[3]。例如，组氨酸由CAT碱基编码，而脯氨酸由CCT碱基编码，由于自然遗传突变，胞嘧啶被腺嘌呤（C→A）所取代，因此A1型β-酪蛋白是由A2型β-酪蛋白肽链的第67位脯氨酸突变为组氨酸导致的变体。据研究考证，这次遗传突变发生在大约五千至一万年前的土耳其安纳托利亚[4]，后来A2型和A1型又分别发生了一系列微小的变异形成了其他变体。β-酪蛋白八种主要变体的氨基酸序列变化情况如表1所示。

表1 β-酪蛋白8种主要变体的氨基酸序列变化情况

1.2 β-酪蛋白基因分型方法

基因多态性是指在基因组水平上，由于碱基的缺失、插入、重复或置换等引起的核酸序列的变异，导致同一基因位点可存在两种或多种基因型。Martin等[5]的研究表明，乳蛋白多态性是受常染色体上共显性基因所控制的，因此β-酪蛋白的A1和A2等位基因具有相同机率表达A1型或A2型β-酪蛋白。β-酪蛋白基因多态性可通过蛋白水平或分子水平进行检测。蛋白水平的检测方法主要包含反相高效液相色谱(Reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)、毛细管区带电泳[6-7]、等电点聚焦[8]、双向凝胶电泳[9]等方法。分子水平的检测方法主要包含等位基因特异性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)、限制性片段长度多态性PCR(PCR restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)、单链构象多态性PCR(Single strand conformation polymorphism PCR,SSCP-PCR)、创造酶切位点PCR(Amplification created restriction site PCR,ACRS-PCR)等方法，近年来还出现了TaqMan法、焦磷酸测序法等新兴的β-酪蛋白基因检测技术。

1.2.1 RP-HPLC方法

RP-HPLC方法操作简便，灵敏度高，是最常见的用于分离和定量牛乳中蛋白质变异体的方法，具有很大的应用潜力。缪淑颖等[10]采用RP-HPLC方法检测了102头中国荷斯坦奶牛牛乳中6种主要乳蛋白的多态性，结果表明β-酪蛋白的类型最多，并成功测定了A1和A2的基因型频率。Bonfatti等[11]也成功应用RP-HPLC方法在40 min内分离鉴定了地中海水牛乳中不同基因类型的酪蛋白和乳清蛋白。

1.2.2 AS-PCR方法

AS-PCR方法是指在引物3'端设计与模板(等位基因)匹配或错配的碱基，通过扩增出相应的基因片段达到区分模板(等位基因)的目的。Keating等[12]和Rahimi等[13]在研究牛群β-酪蛋白基因分型时都基于该方法，设计正向引物为5'-GCC CAG ATG AGA GAA GTG AGG-3'，反向引物1(A1等位基因)为5'-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AT-3'，反向引物2(A2等位基因)为5'-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AG-3'，当加入不同特异反向引物1或2进行PCR扩增后，可根据DNA片段条带的不同来区分和鉴定A1或A2等位基因。

1.2.3 PCR-RFLP方法

PCR-RFLP方法是指用特异设计的PCR引物扩增靶DNA，再用特异性内切酶将扩增产物切割成不同长度的DNA片段，最后通过凝胶电泳分析。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，因此可以产生不同长度的条带，从而区分出不同的等位基因，该方法操作简便，耗时较短，是利用分子手段检测基因分型的常用方法。Miluchová等[14]和Shende等[15]都根据McLachlan[16]的专利内容，设计了一对引物5'-CCT TCT TTC CAG GAT GAA CTC CAG G-3'和5'-GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT-3'，分别对斯洛伐克平茨古牛和荷斯坦牛的DNA样本进行PCR扩增，均可获得长度为121 bp的DNA片段，利用Dde I限制性内切酶切割后进行电泳分辨，成功测定了A1和A2的等位基因频率和基因型频率。

1.2.4 SSCP-PCR方法

SSCP-PCR方法是一种基于单链DNA空间折叠构象差异点状突变的检测方法。相同长度的单链DNA如果碱基排列顺序不同就会导致不同的空间折叠构象，在经过PCR扩增和产物复性后，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同构象DNA的泳动速度就会不同，据此可判断DNA片段中发生了碱基突变。Barroso等[17]运用此方法成功鉴定了65只不同牛种的β-酪蛋白A1、A2、A3和B等位基因，并认为此方法经济、高效、灵敏。Cui等[18]也采用该方法鉴定了中国麦洼牦牛β-酪蛋白的基因类型，新发现了两种麦洼牦牛β-酪蛋白遗传变体(JN 655524和JN 655525)，它们显示出明显不同的电泳迁移模式。

1.2.5 ACRS-PCR方法

ACRS-PCR方法是指应用引物错配技术结合单碱基突变位点而形成一个酶切位点，其PCR扩增产物可以用PCR-RFLP方法分析，从而对单碱基突变位点进行基因型鉴定。Hanusová等[19]使用该方法鉴定了斯洛伐克97头荷斯坦奶牛β-酪蛋白的A1和A2基因型。Ramesha等[20]利用此法结合TaqI限制性内切酶对印度391头水牛进行了β-酪蛋白A1和A2基因型的鉴定，发现A2纯合型PCR扩增片段长度为251 bp，A2基因型频率为100%。

1.2.6 TaqMan方法

TaqMan方法是近年来发展起来的综合PCR与荧光标记技术用来准确定量PCR的代表性方法，由引物和探针双重控制目标序列的选择，克服了传统PCR方法费时、易污染等缺点，具有简单易操作、特异性强、灵敏度高等优点。Manga等[21]采用TaqMan荧光探针建立了一种新的等位基因鉴定方法，用于检测120头荷斯坦奶牛β-酪蛋白的A1和A2基因型，结果发现与ACRS-PCR法相比，TaqMan法检测β-酪蛋白基因标记物更有效，具有100%的可靠性，且灵敏度高出100倍。Poulsen等[22]通过该方法分析丹麦荷斯坦奶牛、丹麦泽西牛、瑞典红牛等3个奶牛品种的牛乳凝固特性与酪蛋白遗传变异的关系，研究表明TaqMan法成功地对所有常见的αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白变体进行基因分型。

1.2.7 焦磷酸测序方法

焦磷酸测序法是近年来兴起的一项DNA快速测序技术，适于对短到中等长度的DNA序列样品进行测序分析，具有高通量、低成本、精确性和重复性好等特点，因而广泛应用于单核苷酸多态性、毒理学及病原微生物鉴定等多个领域。任大喜等[23]使用该方法分析了中国荷斯坦牛、娟姗牛及水牛的乳蛋白基因多态性，并采用高效液相色谱法进行验证，结果表明焦磷酸测序法能高通量、快速且准确地测定乳蛋白基因多态性。Zhong等[24]使用该方法分析了85种来自不同乳源和地理位置的天然发酵乳品中微生物的多样性，发现该方法可以大量快速地测定不同样品微生物的16SrRNA基因。

1.3 β-酪蛋白基因频率

目前国际上主要的奶牛品种包括荷斯坦牛、娟姗牛及西门塔尔牛，其他品种还有亚洲地区的水牛和牦牛，欧美地区的更赛牛、爱尔夏牛、褐牛和红牛等。研究表明，β-酪蛋白的基因频率及基因型频率因奶牛的品种、国家或地理分布等因素影响而呈现显著差异[25]。Misra等[26]研究了印度不同地区产奶动物的β-酪蛋白基因分型情况，发现8个品种231头水牛样本的A2等位基因频率为100%。任大喜等[23]分析中国荷斯坦牛和娟姗牛的乳蛋白基因多态性，发现荷斯坦牛β-酪蛋白的基因型以A1纯合型为主(67.78%)，A1等位基因频率为69.44%，A2等位基因频率为28.89%；娟姗牛β-酪蛋白的A1等位基因频率为32.46%，A2等位基因频率为42.11%。Winkelman等[27]研究了新西兰本地1328头娟姗牛酪蛋白的基因差异，发现A2等位基因频率为59.1%。Eenennaam等[28]研究了美国加利福尼亚州21个农场5种奶牛所产牛奶的蛋白质多态性，发现瑞士褐牛的A2等位基因频率为54%左右。Bech等[29]研究了丹麦3种奶牛酪蛋白的基因多态性，发现丹麦红牛的A2等位基因频率仅为23%。总的来说，亚洲地区本土的水牛等奶牛品种生产的牛乳大部分是A2型，而欧美及澳新地区的杂交奶牛如荷斯坦牛、娟姗牛、丹麦红牛、爱尔夏牛等品种普遍生产A1型牛乳[30]。

2 BCM-7及其生成机制

2.1 BCM-7

β-酪蛋白富含生物活性肽，对铁、钙、锌、镁等微量金属元素离子的运输发挥着至关重要的作用。Brantl等在1979年首先发现了豚鼠在饲喂一种酪蛋白酶解制剂时其回肠纵行肌毛细血管中存在一种呈阿片活性的物质，为β-酪蛋白第60-66点位上的氨基酸残基片段(Tyr60-Pro61-Phe62-Pro63-Gly64-Pro65-Ile66)，命名为β-酪啡肽-7(BCM-7)。它具有很高的阿片活性，能与μ型阿片受体表现出良好的亲和力[31]。

2.2 BCM-7的生成机制

A1型β-酪蛋白在肽链第67号点位上是组氨酸，而A2型β-酪蛋白是脯氨酸，这种差异造成A1和A2型β-酪蛋白第66与第67氨基酸之间肽键的敏感性不同，导致对人体消化道的酶解反应也不同。异亮氨酸和组氨酸之间(A1型)的肽键在消化道内可被弹性蛋白酶裂解，而异亮氨酸和脯氨酸之间(A2型)的肽键不会被裂解，因此，只有A1型β-酪蛋白在正常酶解后会产生BCM-7，A2型则不会产生[32]。其生成机制如图1所示。

图1 A1和A2型β-酪蛋白肽链结构及BCM-7的生成

3 BCM-7对人体健康的潜在影响

牛乳具有丰富的营养，能为人体提供大量优质的蛋白质及微量元素，早已成为西方发达国家人们的必备食物之一。随着BCM-7的发现以及对乳源生物活性肽的深入研究，国外越来越多的研究表明BCM-7可能与1型糖尿病、心血管疾病、精神障碍、胃肠道不适等疾病的发生有着显著的联系，引起了西方各国学者的普遍重视，但我国在这方面的研究还比较欠缺。由于BCM-7只产生于含有A1型β-酪蛋白的牛乳，这将引发人们对饮用A1型牛乳对健康影响的担忧。

3.1 1型糖尿病

1型糖尿病是一种自身免疫系统缺陷疾病，多发生在儿童和青少年，患者体内的多种异常自身免疫抗体损伤了胰腺B细胞，导致其不能正常分泌胰岛素，患者需要每天注射胰岛素来控制血糖水平[33]。Laugesen等[34]对英国、芬兰、瑞典等19个国家12913名0-14岁的儿童进行了牛乳蛋白每日摄入量与1型糖尿病发病率的关系数据研究，结果显示A1型牛乳、总乳蛋白和A2型牛乳与1型糖尿病发病率的相关系数(r)分别为0.92、0.68和0.47，说明A1型β-酪蛋白的摄入及其代谢产物BCM-7与1型糖尿病的发生有密切关系。对于饮用牛乳引发1型糖尿病的潜在作用机制目前仍然存在争议，一方面有研究[35-37]认为，BCM-7可以抑制机体的免疫系统，增强病原体如肠道病毒或细菌的存活率，这些病原体最终参与引发1型糖尿病。另一方面的研究[38-39]认为，BCM-7的氨基酸序列结构与葡萄糖转运蛋白-2(Glucose transporter-2，GLUT-2)类似，BCM-7会模拟GLUT-2参与细胞内的葡萄糖转运并激活免疫应答机制，T细胞将它们识别为抗原并刺激B细胞产生抗体，抗体不仅靶向BCM-7，而且还会靶向产生胰岛素的B细胞，从而引起1型糖尿病。

3.2 心血管疾病

缺血性心脏病或冠心病是心血管疾病的主要类型。Laugesen等[34]研究了1975年至1995年间18个国家的人群膳食结构与缺血性心脏病的联系，发现35-64岁患缺血性心脏病的死亡率与A1牛乳摄入量之间的相关系数(r)为0.76-0.82，与其他摄入膳食指标相比，A1牛乳的摄入量与缺血性心脏病之间的相关性最为密切。McLachlan[40]也研究了16个国家30-69岁年龄段的男性摄入A1型牛乳与缺血性心脏病发病率之间的关系，发现因该疾病导致的死亡率和牛乳中的蛋白质有很强的相关性(r=0.86)，并推测BCM-7是导致心血管疾病的重要病因。研究表明[35,41-42]，BCM-7可能参与低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）的氧化过程或者LDL脂质组分的过氧化过程，氧化后的LDL可与巨噬细胞表面的特定受体结合并被巨噬细胞吞噬，这些巨噬细胞最终会转化为泡沫细胞，从而导致心脏动脉粥样硬化。Heinecke[43]的研究也证实了这种可能性，他分析了从人体动脉粥样硬化病变组织分离出的蛋白质氧化产物，发现酪氨酸自由基在LDL的氧化反应中扮演重要角色，这也间接表明BCM-7与心血管疾病的发生关系密切。

3.3 精神障碍疾病

自闭症和精神分裂症都是精神障碍疾病，最典型的特征是社交障碍，主要表现为社交隔离、言语困难、智力发育障碍、活跃过度、自戕自残、恐慌发作以及无目光接触等，这些障碍症状可以通过改变饮食习惯来改善[44]。Cade等[45]对70名1-8岁的儿童自闭症和精神分裂症（漏肠综合征）患者的跟踪研究显示，这些患者的尿液中可以检测出大量的BCM-7，通过无麸质和无酪蛋白的饮食后，尿液中的BCM-7含量明显降低，81%的患者的精神障碍症状得到显著改善。另有研究证实[46,47]，麦醇溶蛋白和酪蛋白可释放胃肠内的炎症细胞因子，而炎症性肠病患者同时患自闭症、抑郁症在内的精神障碍疾病的几率会增加。

3.4 消化功能紊乱

部分人群饮用牛乳后会出现腹胀、腹泻、肠绞痛等不适症状，通常认为是这部分人群患有乳糖不耐受。乳糖不耐受是由于人体肠道乳糖酶含量少，不能完全消化分解牛乳中的乳糖所引起的，不同国家或地区乳糖不耐受发生率不同，在远东地区发生率较高。但Sun等[48]对我国45名汉族人群分别饮用A1型和A2型牛乳的研究显示，有些乳糖不耐受病例或许与乳糖无关，可能与饮用含有A1型β-酪蛋白的牛乳有关，潜在的机制是A1型β-酪蛋白经消化酶解后可产生BCM-7，其发挥一系列促炎症作用破坏了正常的消化过程从而表现出乳糖不耐受的症状，而饮用A2型牛乳则可缓解或预防乳糖不耐受症状。Ho等[49]对41名志愿者进行了为期8周的随机双盲交叉试验，结果表明与A2型牛乳相比，摄入A1型牛乳会导致更高的大便稠度值（布里斯托大便分类法），大便稠度值与腹痛之间也有显著关系(r=0.52,p=0.001)，这与A1型牛乳含有BCM-7密切相关。

4 展 望

过去二三十年间，世界各国对牛乳中β-酪蛋白的基因分型及BCM-7的生理特性进行了广泛研究，统计数据显示，长期饮用A1型牛乳与1型糖尿病、心血管疾病、自闭症等人体非传染性疾病的发生有显著的相关性，但同时动物及人体试验结果仍旧没有给出实质性的证据，因此A1型牛乳是否致病仍存在争议。

随着我国人民生活水平的提高和对美好生活的追求，人们对优质、安全、营养、易消化吸收的牛乳及其制品的需求不断提升，对牛乳的消费认识已经从“喝上奶”向“喝好奶”转变。虽然亚洲地区本土奶牛品种生产的牛乳大部分属于A2型，但随着本地区牛乳消费量的激增，亚洲各国引进了许多欧美及澳新地区的高产奶牛或者进行杂交改良，这个过程可能会引入A1等位基因。鉴于A1型牛乳对人体健康影响的不确定性，未来普通型牛乳和A2型牛乳的消费人群会得到细分，A2型牛乳或将成为一种高端产品面向市场，相关科研机构及乳制品企业也将加大A2型牛乳及其对人体健康影响方面的深入研究。