乌日汗，包连胜，包秀萍，李爽，王歆远，贾士儒

(1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028043；3.内蒙古民族大学附属医院康复保健医院，内蒙古通辽 028000）

0 引 言

酸马奶，又名策格、马奶酒，是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌混合发酵而成的发酵乳制品，比一般的酸奶具有更高的营养及食疗价值。据文献报道，酸马奶对结核病为主的传染性疾病、消化系统疾病、心血管系统疾病等均有明显的辅助治疗作用[1-4]。目前，酸马奶主要分布于蒙古国、俄罗斯及我国内蒙古、新疆等地，且由于受到地理地貌、气候环境、奶源、发酵温度和时间等多种因素的影响，各地酸马奶的化学组成、微生物菌群结构、风味特征等有所差异。发酵乳的风味特性同发酵乳的质地特性及产品安全性一样是消费者接受该产品时考虑的关键因素[5]。风味能影响消费者对产品的偏爱，尤其能给消费者气味感受的挥发性物质是吸引消费者的第一道门。因此，对酸乳制作者来说阐明由酸乳的不同挥发性成分所产生的风味特征是非常重要的[6]。酸乳的挥发性风味物质的来源除了奶源、加工过程变化以外，主要由微生物脂类代谢、糖代谢和蛋白质水解等不同代谢途径所产生[7]。1982年，Marshall等[8-9]就对发酵乳中的风味物质进行了研究，并将这些风味物质归类为碳氢化合物、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、内酯类、含硫化合物、吡啉与呋喃衍生物等。

固相微萃取（solid phase microextraction,SPME）是国际上二十世纪九十年代新发展起来的一项简单有效的吸附洗脱技术，且萃取简便、快速、经济、安全、无溶剂、选择性好、灵敏度高，可直接与气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）、毛细管电泳仪（capillary electrophoresis,CE）等联用，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，大大加快了分析检测的速度[10-12]。因此广泛应用于酒类、药材、食品等挥发性风味物质的检测，其中也不乏对于乳剂及乳制品挥发性成分的检测相关报道[13-18]。为了深入了解科尔沁地区食疗用酸马奶风味物质组成及含量，本实验利用SPME-GC-MS检测分析酸马奶发酵过程中挥发性风味物质组成及含量变化，并采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）探讨分析酸马奶发酵各时间点关键性风味物质，同时利用主成分分析法探究表征各时间点关键挥发性风味物质，以期为深入研究酸马奶风味物质形成机理提供参考依据，同时为其标准化、自动化发酵控制和生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

GCMS-QP2010气相色谱与质谱联用仪，岛津公司；HP-INNOWax毛细管柱（30m×0.25 mm，0.25 μm），美国Agilent Technologies；手动固相微萃取进样手柄、50/30μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS）萃取头，美国Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵与取样

酸马奶酿制地点为内蒙古通辽市科尔沁区某家医院，酿制过程参照医院传统做法。发酵剂为医院保存的酸马奶。在专用发酵容器中，将鲜马奶与上述发酵剂按3∶1的比例混合均匀，白天每隔2 h用专用布鲁尔捣拌30 min，每次捣拌结束均用干净纱布封住容器口。全程发酵品温24～26℃，总发酵时间为96 h。酸马奶发酵过程中每12 h采集一次样品，装入样品瓶中封口，液氮冷却后立即带回实验室保存于-80℃，进行后续实验。

1.2.2 挥发性物质的测定

样品前处理：取待检样品5 mL置于20 mL装有磁力搅拌子的顶空采样瓶中，45℃恒温水浴中加热平衡30 min，将手动SPME进样器固定在SPME搭载装置上，并将针头插入顶空瓶中，推出萃取纤维，顶空吸附萃取60 min。吸附时间结束以后，将萃取头插入GC-MS进样口250℃解析3 min。

GC条件：采用程序升温方式，起始温度50℃，保持1 min，以3℃/min升温速率上升至180℃，保持1 min，以8℃/min上升至250℃，保持3 min；进样口温度为250℃；载气为氦气，流速1.0 mL/min；不分流进样。

MS条件：电离方式为EI源；电子能量70 eV；离子源温度220℃；质量扫描范围m/z 33-450 AMU；发射电流100μA。

1.2.3 定性与定量分析

利用随机携带工作站，NIST08标准库自动检索各组分质谱数据，利用面积归一化法计算各组分相对峰面积比（即每种风味物质组分峰面积占离子色谱图中所有风味物质总峰面积的百分比)。

1.2.4 关键挥发性风味物质的评价

参照刘登勇[19]等确定食品风味化合物的新方法，即ROAV法确定酸马奶中关键挥发性风味物质。首先定义对样品风味贡献最大的组分为ROAVmax，其他香气成分ROAV值则按以下公式计算：

式（1）中：

Ci：各挥发性物质的相对含量（%）

Tii：各挥发性物质的感觉阈值（μg/L）

Cmax：对样品总体风味贡献最大组分的相对含量（%）

Tmax：对样品总体风味贡献最大组分的感觉阈值（μg/L）

通常认为ROAV≥1的组分为所测样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对所测样品的总体风味具有重要修饰作用[19-20]，即该值越大的物质对酸马奶样品整体风味的贡献越大。

1.3 数据统计分析

将归一化峰面积（变量）输入到SIMCA软件（Simca-P11.5，Umetrics，San Jose，Calif）进行多元统计分析，数据进行中心化和正交信号校正处理之后，进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘（partial least squares，PLS）分析。首先，对不同发酵时期酸马奶样品GC-MS数据进行无监督PCA分析，并在PCA得分图上进行样品之间差异的分析。为了进一步确定与酸马奶风味相关的挥发性物质，进行有监督PLS分析。基于7倍交叉验证PLS模型分析产生的载荷图与VIP值（VIP＞1）来确定引起各时期样品差异的风味物质。

使用SPSS20.0（http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/）软件对数据进行统计分析，P值小于0.05被认为显著。

2 结果与分析

2.1 挥发性风味物质的组成及含量的变化

本研究中，9个不同时间点酸马奶样品共检测出54种风味物质，包括酸类化合物、酯类化合物、醛类化合物、醇类化合物、酮类化合物、芳香族化合物等6大类风味物质，且各时期种类最多的均为酯类化合物，如图1所示。

图1 酸马奶发酵过程中各类挥发性风味物质数量变化

酯类化合物因其感觉阈值较低，对发酵乳的风味影响很大，是重要的风味物质之一。在酸马奶发酵过程中酯类化合物的变化情况可分为三大类：发酵全程均检测到的、发酵期间消失的和发酵期间新增的。第一大类的酯类化合物共有12种，其中相对峰面积比最高的为辛酸乙酯，在0～12 h由12.27±0.42（%）显著增加至51.24±1.98（%）（P＜0.01），后均值有所下降，但差异不显著（P＞0.05）。其次为癸酸乙酯，0～12 h由9.37±0.80（%）显著增加至21.53±0.74（%）（P＜0.01），后有所增加，84 h出现最高均值25.81±1.27（%），但各时间点差异不显著（P＞0.05）。剩余10种酯类化合物大部分变化趋势一致，均在0～12 h显著增加（P＜0.05），后虽有持续增加趋势，但差异不显著（P＞0.05）。属于第二大类的酯类物质包括戊酸甲酯、辛酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、11,14-二十碳二烯酸甲酯等。第三大类，即新增出现的酯类化合物有乙酸乙酯、乳酸异戊酯、乙酸异戊酯、丁位壬内酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯和辛酸丙酯等7种，其中除了乙酸乙酯，其余6种含量均较低。酸马奶发酵期间几种主要酯类化合物的相对含量变化见图2。Cheng[21]等报道，大多数酯类化合物都具有水果和花类香气，可能有助于降低发酵乳中脂肪酸和胺的尖锐、苦涩味道。

图2 酸马奶发酵过程中几种主要酯类化合物的变化

酸类物质也是发酵乳制品中主要风味物质之一。本实验中，发酵0 h，检测到4种酸类物质，即辛酸、正癸酸、肉豆蔻油酸、4-甲基-2-氧代戊酸，相对峰面积比分别为4.17±0.47、1.87±0.67、0.02±0.01、0.18±0.03（%），在之后的各时间点此四类物质持续存在；发酵12 h，新增的酸类物质有亚油酸，相对峰面积比为0.05±0.01（%），且84 h之前均有检测到；发酵24 h时新增酸类物质异戊酸的相对峰面积比为0.09±0.03（%），之后其含量呈逐渐上升趋势；在发酵36 h酸类物质种类增加至7种，即辛酸、正癸酸、肉豆蔻油酸、4-甲基-2-氧代戊酸、亚油酸、异戊酸和异丁酸，其相对峰面积比分别为2.11±0.62、0.62±0.32、0.05±0.01、0.31±0.03、0.08±0.02、0.24±0.06、0.03±0.01（%）。除了第一次出现的异丁酸和极显著增加至最高值0.31±0.03（%）的4-甲基-2-氧代戊酸（P＜0.01）以外，其它物质含量与前一时间点相较无显著差异（P＞0.05）。发酵48 h时正癸酸含量由36 h时的0.62±0.32（%）显著增加至0.92±0.23（%）（P＜0.05），其它物质无显著差异（P＞0.05）。发酵60 h，9-癸烯酸第一次出现，相对峰面积比为0.11±0.02（%），因此该时间点酸类物质种类增加至8种。发酵84 h时亚油酸虽从此消失，但新出现一种化合物即月桂酸，相对峰面积比为0.11±0.02（%），且在96 h也仍稳定存在。96 h时辛酸、正癸酸和异戊酸相对峰面积比均值达到最高值，分别为3.23、1.16和0.75（%）。各时间点样品主要几种酸类物质的变化趋势见图3。在所有脂肪酸中，真正对奶香味有贡献的有4种脂肪酸，其中就包括辛酸和癸酸[22]。刘梅森等[22]对市售的11个奶粉样品的脂肪酸组成以及含量进行检测后指出，可以用辛酸和癸酸的含量高低来判断乳脂风味的优劣，辛酸和癸酸含量越高则赋予奶制品奶香味品质越好。异戊酸，即3-甲基丁酸，发酵12～24 h期间产生且含量逐渐升高，可赋予发酵乳芝士样气味[23]。同时，酸类物质也可体现酸马奶保健功能特色，例如辛酸可以促进胃排空，利于消除功能性消化不良患者的临床症状[24]；月桂酸进入人体后与甘油结合成单月桂酸甘油酯，后者具有抗病毒和抑菌特性[25]；异丁酸，作为一种短链脂肪酸，对机体也有着重要的生理功能[26]。

图3 酸马奶发酵过程中几种主要酸类化合物的变化

醇类物质可以转化成酸，是发酵乳不可或缺的风味物质。本研究中，发酵0 h的酸马奶样品中共检测到11种醇类物质，即异戊醇、1-壬醇、正辛醇、2，7-二甲基-4，5-十一烷二醇、2-庚醇、正庚醇、1-戊醇、1-己烯-3-醇、2-乙基己醇、1，14-十四烷二醇和（Z，Z，Z）-9，12，15-十八三烯-1-醇，相对峰面积百分比分别为14.34±1.76、0.54±0.03、0.93±0.11、0.09±0.01、0.49±0.05、0.63±0.13、0.34±0.02、0.27±0.01、1.17±0.07、0.29±0.03和0.35±0.02（%）。其中前六种醇类物质在整个发酵时期持续存在，且异戊醇相对含量高于其余5种，其变化趋势见图4。剩余5种化合物只有0 h检测出，其余时间点均未检测到。发酵12 h时除了持续存在的6种醇类化合物以外，新增二异丁基甲醇和乙醇，相对峰面积比为0.11±0.02（%）和8.78±0.94（%）。该时间点产生的乙醇在之后的各时间点持续并稳定存在（如图4所示）。酸马奶的醇味主要由乙醇形成[27]。发酵24 h时，除了2-庚醇由12 h的0.01±0.00（%）显著增加为0.03±0.01（%）（P＜0.05）以外，其它醇类化合物无显著差异（P＞0.05）。发酵36 h新增一种醇类化合物2-壬基醇，此时醇类化合物数量变为9种，且此9种化合物在之后的时间点也仍持续存在。由于醇类化合物风味阈值较高，其对酸马奶的风味贡献并不大[28]。

图4 酸马奶发酵过程中乙醇和异戊醇的变化趋势

酮类化合物多是由不饱和脂肪酸的氧化、热降解，氨基酸降解或微生物代谢产生[28]。本实验中发酵0 h时共检测到4种酮类化合物，分别为2-壬酮、2-庚酮、3-羟基-2-丁酮和甲基庚烯酮。其中能赋予发酵乳水果味的2-壬酮和2-庚酮在整个发酵时期持续存在，且变化趋势基本相似。如图5所示，二者相对峰面积百分比均在0～12 h和36～60 h之间显著下降（P＜0.05），而后趋于稳定。3-羟基-2-丁酮，又名乙偶姻，是发酵乳产品中普遍存在的一种对风味有重要影响的酮类化合物，它能够赋予发酵乳奶油、脂肪和令人愉快的奶香气[21,29]。本实验中乙偶姻在0～48 h的各时间点均可检出，且相对峰面积百分比无显著差异（P＞0.05）。发酵60 h时并未检测到该物质，然而72 h再次出现且显著增加至最高值2.26±0.61（%），而后重新消失。乙偶姻具有强烈的奶油香气，对酸乳奶香味的增加起到决定性作用，但作为一种重要的平台化合物，合成后并不能稳定存在，可在乙偶姻还原酶的作用下被还原为2，3-丁二醇。该现象也是乙偶姻的一项重要的生理功能，即通过与2，3-丁二醇相互转化来调节微生物胞内的氧化还原水平[30]。甲基庚烯酮只在0 h出现并随着发酵时间的延长而消失。

图5 酸马奶发酵过程中酮类化合物的变化趋势

本实验中检测到的两种醛类化合物苯乙醛和异戊醛仅在0 h出现并随着发酵时间的延长而消失。苯乙醇和乙酸苯乙酯是该实验中检测到的两种芳香族化合物。其中苯乙醇在发酵0 h时相对峰面积百分比为2.00±0.31（%），12 h时显著降低至0.43±0.09（%），而后在36～60 h显著增加，84 h达最高均值1.63（%）。乙酸苯乙酯在0 h并未检测到，12 h时第一次出现且直至84 h峰面积百分比均较低，然而在96 h显著增加至最高值0.16±0.01（%）。苯乙醇和乙酸苯乙酯能赋予酸马奶清甜的花香。

2.2 关键性风味物质的鉴定

发酵乳的风味是由各挥发性风味物质的阈值与其在整体风味中的含量共同决定的[9]。为确定本实验中关键性风味物质，按照公式（1）计算得出各组分的ROAV值（见表1），该值可准确地评价单一香气组分对整体风味的贡献程度。一般认为ROAV≥1的物质为所测样品的关键性风味物质，0.1≤ROAV＜1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用[19]。

结果表明，已定性的多种挥发性风味物质中对酸马奶整体风味有较大影响的物质所占比例较小。由表1可知，表征发酵起始（即0 h）的关键性风味物质（ROAV≥1）有异戊醛、辛酸乙酯、苯乙醛。异戊醛的风味贡献率最大，能给马乳带来令人愉快的类似苹果的香气；辛酸乙酯贡献率排第二，能赋予马乳类似杏的果香、奶油香、牛奶香和甜酒的香气[31]；苯乙醛能赋予马乳类似杏仁、樱桃等的香气。辛酸乙酯在整个发酵过程中对整体风味的贡献率均较大，其余两种即异戊醛和苯乙醛在之后的发酵过程中均消失，因此该两种物质是由马乳带来的。该时间点，对整体风味有重要修饰作用的物质（0.1≤ROAV＜1）有癸酸乙酯、异戊醇、1-壬醇、2-壬酮。发酵初期即12 h时关键性风味物质（ROAV≥1）除了辛酸乙酯以外还有癸酸乙酯、乙酸乙酯和正己酸乙酯。对整体风味有重要修饰作用的物质（0.1≤ROAV＜1）有乙酸异戊酯、异戊醇、1-壬醇、2-壬酮、乙偶姻。0～12 h癸酸乙酯含量显著增加，成为了除辛酸乙酯以外，对各发酵阶段酸马奶风味贡献较大的关键风味物质，它能赋予酸马奶类似梨的果香和葡萄酒的香气。

发酵24～72 h各时间点，关键性风味物质为辛酸乙酯和癸酸乙酯，具重要修饰作用的物质共有四种：乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯和乙偶姻。前三种对此阶段的每个时间点样品均有风味修饰作用，但乙偶姻只对72 h样品有修饰作用。表征发酵后期（即84 h和96 h两个时间点）的关键性风味物质和重要修饰作用物质基本相似，分别为辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯（ROAV≥1）和乙酸异戊酯、正己酸乙酯、1-壬醇（0.1≤ROAV＜1）。唯一区别是异戊醇，对于84 h的样品具有重要修饰作用（0.1≤ROAV＜1），而对于96 h时的酸马奶无风味修饰作用（ROAV＜0.1）。

观察整个发酵周期发现，随着发酵时间的延长（12～96 h），辛酸乙酯成为了相对峰面积百分比最高，且对风味贡献率最大的化合物。杜晓敏[24]等对内蒙古锡林郭勒地区不同发酵阶段酸马奶挥发性风味物质种类和含量进行了检测，结果也显示各时间点辛酸乙酯相对峰面积百分比最高。各时间点样品间还存在一些差异物质。如乙酸乙酯是12、84和96 h的关键风味物质，它是由乙醇与酸类物质发生酯化反应产生的[32]，具有水果香气和白兰地酒样的味道；正己酸乙酯仅是发酵12 h时的关键风味物质，赋予样品菠萝、香蕉等果香和有力的酒香[31]。以上数据说明酸马奶发酵初期、中期和后期，关键性风味物质在发酵各阶段呈不断变化状态，使酸马奶呈现出不同的风味特征。

2.3 酸马奶发酵过程中各阶段样品挥发性风味物质的相关性分析

为了更直观地了解酸马奶发酵过程中各时间点样品挥发性风味物质的差异，利用非监督模式识别方法即主成分分析法（PCA）对多元数据进行分析。该方法主要应用于对高维数据空间进行降维，从而降低问题的复杂性[41,42]。图6为不同发酵时间点的主成分得分图，图中呈现了样本在新多元空间中的分布，样品点越接近，说明其挥发性风味物质组成及含量的相似度越高。由图6可看出，0 h时的样品在得分图的左侧，与其它时间点完全区分；12、24、36 h三个时间点样品均分布于得分图中心偏左，相互之间未完全区分开；剩余时间点即48、60、72、84、96 h等样品分布于得分图中心点右侧区域，且无法完全区分。

图6 酸马奶发酵过程中挥发性风味物质的主成分得分图

为进一步验证酸马奶发酵各阶段样品之间的差异，本研究又采用有监督模式识别方法—偏最小二乘分析法（PLS）对多元数据进行分析。偏最小二乘模型有很好的拟合性与令人满意的预测性。图7是偏最小二乘法第一主成分和第二主成分得分图与载荷图，其中得分图显示了发酵过程中各阶段挥发性风味物质聚类结果，与PCA分析结果相一致。通过PLS载荷图能够鉴定出对各发酵时间点酸马奶样品聚类差异贡献率显著的代谢物。在载荷图中，载荷值越大，位置距离原点越远的挥发性风味化合物对聚类差异的贡献率也越大。同时，在PLS模型中，VIP系数反应出每种化合物对该聚类差异的贡献，VIP值越高意味着贡献越大[43]。VIP值大于1，证明该化合物对样本间的聚类有显著贡献。如图8所示，癸酸乙酯、异戊醛、苯乙醛、乙醇、异戊醇、9-癸烯酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯等8种挥发性风味化合物的含量对各样本间聚类差异起到主要作用：发酵0 h酸马奶样品与其它时间点完全区分成为单独一类，与异戊醛、苯乙醛呈较强的正相关；发酵12～36 h阶段酸马奶风味与异戊醇呈较强的正相关；发酵48～96 h阶段风味与癸酸乙酯、乙醇、月桂酸乙酯、9-癸烯酸乙酯等化合物呈正相关且未完全区分。

表1 酸马奶发酵过程中关键挥发性风味物质及对应ROAV值

综合以上结果，发酵中后期挥发性风味物质组成和含量稍有差别，但并不显著。就关键性风味物质评价结果而言，84 h和96 h风味基本无差别，但比起发酵中期（36～72 h），香气更加丰富。

图7 偏最小二乘分析得分图与载荷图

图8 偏最小二乘分析VIP图

3 结 论

本研究采用SPME-GC-MS技术检测科尔沁地区酸马奶发酵过程中挥发性风味物质的动态变化，共检测出54种挥发性成分，包括酸类、酯类、醛类、醇类、酮类和芳香族类等，其中种类最多的为酯类化合物。根据ROAV计算结果，这些已定性的挥发性风味物质中对酸马奶整体风味有较大影响的物质所占比例较小。多元统计分析结果表明，发酵0、12～36 h和48～96 h之间有很好的聚类分离效果。其中0 h与其它时间点完全区分成为单独一类，与异戊醛、苯乙醛两种化合物呈较强的正相关；12～36 h阶段风味与异戊醇呈较强的正相关；发酵48～96 h聚为一类，该阶段风味与一些酯类化合物呈正相关。

挥发性风味物质的鉴定是酸马奶发酵过程中质量控制及品质改良的基础。但对于诠释酸马奶整体风味的形成机理，风味物质的定性和定量只是第一步，仍需大量且深入的后续研究，如微生物结构分析、各类风味物质之间的相互作用及释放机制等。关键性风味物质与酸马奶感官特性之间关系的确定，可为质量标准化、统一化且让消费者更容易接受的酸马奶产品的获得提供帮助。