何玉宁，王锡昌，陶宁萍，钟建

（上海海洋大学食品学院农业部水产品加工副产物综合利用技术集成科研基地上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 210306）

0 引 言

鱼油中含有大量的水产品特征活性物质n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFAs），其中DHA和EPA是两种典型的PUFAs，是大脑和视网膜细胞膜的重要组成成分[1]，对人体的健康起着极其重要的作用，具有抗炎抗肿瘤[2]、增强机体抗氧化能力[3]、促进智力视力发育[4]、预防心血管疾病[5]和老年痴呆症[6]等作用；它们极易氧化和酸败，并具有难闻的鱼腥味，其在食品工业中的应用受到了一定限制[7-8]。脂质体技术作为一种包埋方式因其所用组分脂质与细胞膜近似且能够有效提高DHA和EPA的水溶性以及在人体中的消化吸收率[9]而受到国内外的广泛关注，在营养健康食品工业中具有较大的应用潜力。Tahere[8]等于2017年使用加热结合均质的方法制备出鱼油纳米脂质体添加于酸奶中，发现其冷藏21天后的DHA/EPA含量高于添加有未包封的鱼油酸奶组；而此方法耗能较多，且加热易破坏脂质体的结构，导致鱼油的氧化。前人对载n-3 PUFAs的研究多使用氯仿/甲醇作为制备过程中的溶剂[10-12]，此溶剂可能带来较多的毒性和污染。本实验通过挤出法，采用大豆磷脂作为壁材，使用乙醇作为溶剂制备鱼油脂质体，并通过不同孔径聚碳酸酯膜对其尺度进行调控，并将其应用于酸奶的制备中，评价了其对酸奶品质的影响，实现了水产资源的高值化利用，为进一步n-3 PUFAs营养补充乳制品的开发具有一定指导性作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

DHA和EPA标品均购于美国Sigma公司；无水乙醇、正己烷、甲醇、邻苯二甲酸氢钾、无水磷酸氢二钠和无水磷酸二氢钾均购于中国国药集团；鱼油（EPA+DHA 70%）购买于西安绿腾生物科技有限公司；大豆磷脂（卵磷脂含量60%）购自天津鹤喜园磷脂科技有限公司；聚碳酸酯膜（100 nm,400 nm,1 000 nm）购自北京希凯生物技术有限公司；酸奶发酵剂购于安琪酵母股份有限公司；脱脂乳粉购买于纽瑞滋食品有限公司。

1.1.2 仪器设备

Avanti脂质体挤出仪购于美国Avanti Polar Lipids公司；LAUDA Ecoline电热恒温水浴箱购于江苏大唐医疗器械有限公司；LGJ-12真空冷冻干燥机购于北京松源华兴生物技术有限公司；IKA RV10数显型旋转蒸发仪购于艾卡广州仪器设备有限公司；Grimm 1109激光粒度分析仪购于德国Grimm公司；SP-300透射电子显微镜购于美国FEI公司；XH-D旋涡震荡仪购于无锡久平仪器有限公司；H 1850台式高速离心机购于湖南湘仪动力测试仪器有限公司；PHSJ-3F型/0.01级pH计购于上海仪电科学仪器股份有限公司；Heraguard ECO超净工作台购于美国Thermo Scientific；MJJ-160恒温发酵培养箱购于常州市亿能实验仪器厂；GC-2010气相色谱仪购于岛津企业管理（中国）有限公司；Fox 4 000电子鼻购于法国Alpha M.O.S公司。

2 实 验

2.1 鱼油纳米脂质体的构建及表征

精密称取一定比例大豆磷脂和鱼油溶解于乙醇中，然后在常温的条件通过旋转蒸发（转速100 rpm）减压干燥除去有机试剂，在磨口玻璃管底部及内壁形成一层均匀的脂质薄膜后，将其冷冻干燥6～8 h除去残留有机试剂。加入适量超纯水旋涡震荡水化1 min左右，至形成乳白色均匀的多层脂质体囊泡后转移至Avanti脂质体挤出仪配套的气密注射器中，将其挤压分别通过孔径为100 nm、400 nm和1 000 nm的聚碳酸酯膜各20次来回[13]，制得3种尺寸的大豆磷脂-鱼油纳米脂质体，其总脂浓度均为5 mg/mL[14]。

对其外观进行观察，并使用数码相机拍照；采用Grimm粒度仪测定其平均粒径、粒径分布指数(polymer dispersity index,PDI)和Zeta电位，设定波长为633 nm，折射率1.33，黏度值（0.8880 mPa·s），温度为25°C[15-16]。

2.2 鱼油纳米脂质体酸奶的制备

首先将不锈钢器皿用100℃沸水冲洗消毒，再按照脱脂乳粉：水的质量比为1∶5称取脱脂乳粉和水于器皿中搅拌均匀，并使其在95℃水浴锅中杀菌10 min，接着打开超净工作台，将样品放入超净工作台内冷却至45℃后，向其中接种质量分数为0.1%的乳酸菌，并轻微摇晃搅拌均匀。随后按照脂质体：乳液体积比为1∶5分别量取通过孔径为100 nm、400 nm和1 000 nm的聚碳酸酯膜制备出的鱼油脂质体和乳液混合均匀并分装在玻璃瓶中，盖上盖子并密封好放入42℃恒温培养箱中发酵约10小时后乳液凝固[17]，即得到鱼油纳米脂质体酸奶，放入4℃冰箱进行后续分析测定。

2.3 pH、持水性和外观气味考察

2.3.1 酸奶p H值的测定

p H缓冲液的配制：将邻苯二甲酸氢钾放置于高温烘箱中调至120℃干燥到恒重，并放入干燥器内冷却至室温，精密称取邻苯二甲酸氢钾10.211 g并加入超纯水溶解，转入容量瓶中定容至1 L，即配得p H值为4.00的缓冲液1；将无水磷酸氢二钠和无水磷酸二氢钾放置于高温烘箱中调至120℃干燥到恒重，并放入干燥器内冷却至室温，精密称取无水磷酸氢二钠3.549 g和无水磷酸二氢钾3.402 g并加入超纯水溶解，转入容量瓶中定容至1 L，即配得p H值为6.88的缓冲液2。

pH计的标定[18]：打开pH计，点击温度，待其显示出稳定的温度值后点击确认，调至测量页面，用超纯水冲洗电极3～4次后擦干，插入标准缓冲液1中，待数值稳定后点击定位使p H值为4.00后点击确认；同样用超纯水清洗电极擦干后插入标准缓冲液2中，标定其pH值为6.88后确认。

在标定完成后取一定量样品让其达到室温，将p H计调至测量页面，用超纯水冲洗电极3～4次后擦干，插入样品中，并轻轻搅拌，待p H计上的数值稳定后，读出样品的pH值并记录。

2.3.2 酸奶持水性的测定

称取酸奶样品3 g左右于离心管中，并提前测量好空离心管的重量，记录数值。将装有酸奶样品的离心管放入离心机中以500 rpm离心5 min后取出，倒去上清液，称量离心后去除上清液的重量并记录。

持水性（WHC）可由以下公式计算得出：

2.3.3 酸奶外观和气味的考察

将酸奶样品等量分装于小玻璃瓶中，分别将添加有超纯水、通过100 nm、400 nm和1 000 nm滤膜的鱼油脂质体酸奶做好标记，放于4℃冰箱中储存，分别于1 d、7 d和14 d取出，对其外观和气味进行考察评价。

评价标准为：-：酸奶呈白色，无分层无异味；-+：酸奶呈白色，有少量乳清析出；+：酸奶呈白色有少量乳清和异味；++：酸奶呈微黄色、分层明显，气味腐臭。

2.4 DHA/EPA的定量GC分析

前处理：精密称取1 g酸奶样品于洁净玻璃瓶中，加入3 mL正己烷、3 mL 0.8 mol/L KOH-甲醇和3 mL超纯水，振荡1 h后于37℃恒温水浴中静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清液进行下一步测试分析。

色谱条件：色谱柱：DB-5毛细管柱（30m×0.25mm×0.25um）；检测器：FID；载气：He；载气流量：1.0 mL/min；进样口温度：270℃；柱温：70℃保持5 min，以25℃/min升至200℃，以2℃/min升至240℃；检测器温度：320℃；进样体积：1 uL；进样方式：不分流[19]。

2.5 电子鼻气味轮廓分析

精密称取1 g分别添加有通过100 nm、400 nm和1 000 nm滤膜的鱼油脂质体和等体积超纯水的酸奶样品于洗净并烘干冷却后的10 mL自动进样瓶中，盖好盖子装进机器等待测量，每组样品包含四个平行，选取最优三个平行进行分析。

电子鼻分析条件：载气为洁净空气，流速为150 mL/min，顶空产生温度为50℃，产生时间为600 s，进样器温度为60℃，进样体积为2 500μL，进样时间为1 s，数据采集时间120 s[20-21]。利用仪器中自带的Alphasoft V11统计分析软件对不同酸奶样品数据进行采集和处理。

2.6 数据处理

酸奶p H和持水性的数据采用使用Excel2010软件对其进行均值/标准差的计算和显著性分析。

3 结果与讨论

3.1 鱼油纳米脂质体的表征

3.1.1 鱼油纳米脂质体外观

图1 通过3种不同滤膜孔径所制备出的大豆磷脂-鱼油脂质体及超纯水外观对比图

此图中标记有1、2、3的玻璃瓶中的样品分别为通过孔径为100 nm、400 nm和1 000 nm滤膜的大豆磷脂-鱼油脂质体，其总脂肪浓度均为5 mg/mL，标记有4的玻璃瓶中为等体积的超纯水。由图1可见，通过孔径为100 nm、400 nm和1 000 nm滤膜的大豆磷脂-鱼油脂质体在5 mg/mL浓度下为均匀乳白色液体状，颜色深浅无明显差异，超纯水对照呈透明状；4℃冰箱放置一天后次浓度脂质体样品均无沉淀，说明其品质较好，可作为营养强化剂应用于酸奶中。

3.1.2 鱼油纳米脂质体粒径分布与Zeta电位

由表1可见，鱼油脂质体的平均粒径经Grimm 1109粒度仪测定在123～173 nm之间不等，通过使用不同孔径的聚碳酸酯膜可对鱼油脂质体的尺度进行调控，总体Zeta电位的绝对值在21～39 mv，且尺度的增大会使鱼油脂质体中DHA/EPA的电荷增多，均一度有所减小，说明此鱼油脂质体体系较稳定。

表1 不同尺度鱼油脂质体的平均粒径、PDI、Zeta电位

3.2 鱼油纳米脂质体酸奶的p H、持水性和外观

表2 不同酸奶样品在不同储藏时间的pH和持水性

由表2可以看出，4种酸奶样品的p H和持水性随贮藏时间的推移均呈逐渐下降趋势。pH在1～7 d的减少量明显大于7～14 d的减少量，添加有通过1 000 nm滤膜鱼油脂质体的酸奶其在7～14天pH的减少量相比较于其他样品明显较多，故通过100 nm和400 nm滤膜的鱼油脂质体对酸奶p H的影响较小。

在第一天，添加有通过1 000 nm滤膜鱼油脂质体的酸奶持水性明显低于其他3组酸奶样品，而添加有通过100 nm滤膜鱼油脂质体的酸奶持水性在1～7 d内无明显下降，而在14天4种酸奶的持水性无明显差异，故通过100 nm滤膜的鱼油脂质体使酸奶持水性在1～7天的变化较少。

图2 添加有不同鱼油脂质体和等量超纯水酸奶的外观图

图2左侧中从左到右前4个样品瓶分别呈装了添加有通过孔径为100 nm、400 nm和1 000 nm滤膜的大豆磷脂-鱼油脂质体和等量超纯水的酸奶，展示了其倒放后的外观状态，右图为其正放置的状态，可看出其均呈乳白色，样品倒立不会流出，呈凝固状，4种酸奶外观无明显差异。

评价标准：-：酸奶呈白色，无分层无异味；-+：酸奶呈白色，有少量乳清析出；+：酸奶呈白色有少量乳清和异味；++：酸奶呈微黄色、分层明显，气味腐臭。

由表3可以看出，4种酸奶在制备出后储藏1 d后外观正常，均无分层和异味，都呈乳白色，在储藏7 d后，添加有鱼油脂质体的酸奶均产生一定的异味，有少量分层出现，而超纯水对照组未产生异味；在储藏14 d后，添加有鱼油脂质体的酸奶均产生腐臭的气味，且酸奶呈微黄色，有明显的分层，而添加有超纯水的酸奶与其相比气味较轻，颜色仍为白色。总体来说，添加有三种不同鱼油脂质体的酸奶的外观和气味人工感官在14 d内的变化趋势无明显差异，而添加有超纯水的酸奶外观和气味品质较稳定。

表3 添加有不同鱼油脂质体和超纯水酸奶在不同储藏时间的外观气味特性

3.3 DHA/EPA的定量GC分析

图3 添加有不同鱼油脂质体酸奶储藏一个月后的GC色谱图

图中(a)、(b)、(c)分别代表添加有通过孔径为100 nm、400 nm和1 000 nm滤膜的大豆磷脂-鱼油脂质体酸奶储藏一个月后的GC色谱图。图中EPA和DHA出峰的时间分别约为24.5 min和30.1 min，可看出图（a）的峰形较高，峰面积较大，说明通过孔径为100 nm滤膜的大豆磷脂-鱼油脂质体酸奶在储藏一个月之后的DHA和EPA含量较高，峰面积随滤膜孔径的增大略有减小。

图4 添加有不同鱼油脂质体的酸奶储藏一个月后DHA/EPA的含量

图中样品1、2、3分别代表添加有通过孔径为100 nm、400 nm和1000 nm滤膜的大豆磷脂-鱼油脂质体酸奶样品。由图可见，随脂质体制备过程中滤膜孔径的增加，酸奶储藏一个月后其中的DHA和EPA的含量略微下降，样品2和样品3的EPA含量略高于DHA含量，而样品1的DHA和EPA含量无明显差异。可得出，在酸奶体系中，通过孔径为0.1μm滤膜脂质体可以对鱼油中活性成分DHA/EPA有较好的保护效果。

3.4 电子鼻气味轮廓分析

PC1和PC2分别是PCA转换中得到的第1主成分和第2主成分的方差贡献率，可有效反应原始各气味指标的信息，总贡献率在大多情况下高于85%为宜。由图中可以看出，PC1和PC2已经包含了原始数据的大量信息，PCA图可较好反映添加有不同鱼油纳米脂质体在的酸奶不同时间的气味轮廓差异[22]。

从图5可看出，在酸奶刚制备出的第一天，4种样品气味传感器数据点均有重叠，表明添加有通过不同滤膜孔径的鱼油脂质体酸奶的气味无明显差异，说明脂质体能对鱼油的气味得到较好的包埋效果。

在酸奶放置于冰箱4℃冷藏7 d后，4种样品气味数据点渐渐分散几乎无重叠，其中添加有通过1 000 nm滤膜的鱼油脂质体酸奶与添加有等量超纯水酸奶的数据点较远，气味轮廓差异较明显，而添加有通过100 nm滤膜的鱼油脂质体酸奶与添加有通过400 nm滤膜的鱼油脂质体酸奶的数据点有重叠，气味较接近，表明在经过7天的冷藏后，添加有通过不同滤膜孔径的鱼油脂质体和等量超纯水的酸奶的气味发生了改变，且此部分酸奶样品的气味可得到区分，说明脂质体在酸奶体系中能对鱼油的气味包埋的稳定性在七天有所下降。

在酸奶经过4℃冷藏14 d后，添加有超纯水的酸奶和添加有脂质体的酸奶的气味传感器数据点距离较远，气味轮廓有了明显的差异，而添加有通过3种不同滤膜孔径的鱼油脂质体的酸奶数据点有部分重叠，距离较近，气味轮廓无明显差异，可见鱼油脂质体在酸奶的体系中经过14 d冷藏受到一定的破坏，鱼油均发生酸败氧化，产生挥发性物质，气味品质明显下降，与对照组差异明显。

4 结论与展望

图5 不同酸奶样品在1d、7d和14d的挥发性气味PCA图

本文采用挤出法以大豆磷脂作为壁材制备出不同尺度5 mg/mL的高浓度鱼油脂质体，其外观都呈均匀乳白色，粒径分布整体较集中，均一性随尺度的增加有所下降，其Zeta电位随尺度的增加有所增加；不同尺度鱼油脂质体对酸奶外观的影响无明显差异，而较小尺度鱼油脂质体的添加使酸奶的pH和持水性变化较慢，酸奶经储藏30 d后的DHA和EPA的含量随尺度的增加有所减少；添加有三种不同尺度鱼油脂质体的酸奶与超纯水对照组酸奶在冷藏7天后的气味轮廓出现了一定差异，14天后添加有鱼油脂质体的酸奶与添加有等量超纯水的酸奶的气味出现了明显的差异。使用孔径为100 nm的聚碳酸酯膜挤压法制备的脂质体对鱼油在酸奶中的DHA和EPA具有较好的保护效果，其应用于酸奶加工中具有较大潜力。今后，可进一步对鱼油脂质体应用于酸奶中的气味控制及保藏方法进行研究，实现富含DHA和EPA等营养素酸奶的工业化生产，推动中国乳品工业的发展。