张赢予 张馨木 苗军

(1长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031；2吉林大学药学院；3吉林大学中日联谊医院药学部)

蒽环类药物抗肿瘤活性广谱高效，临床疗效显著，但其累积剂量导致严重的胃肠道反应、脱发、骨髓抑制和心脏毒性等明显的毒副作用。其中心脏毒性作用最常见最严重，明显降低患者生活质量，长期应用甚至导致致死性心肌损伤，显著缩短生存期，极大程度地限制其在临床上的应用〔1〕。寻找相应的治疗方案对其有效抗肿瘤的同时降低诱发心脏毒性风险的意义重大。目前主要预防策略为限制其总剂量，降低累积剂量所致心脏毒性损伤；而心脏保护剂的应用使其保证治疗效果的同时最大程度保护心肌。研究表明，生脉饮(SMY)可通过多种作用机制保护心血管系统，有效治疗心血管疾病〔2〕,能抑制蒽环类药物多柔比星(DOX)诱导的心肌纤维化、调节心脏免疫微环境、抑制心脏重塑、改善心功能〔3〕。本研究观察SMY对DOX诱导心肌损伤的影响并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1实验仪器与材料 心脏彩超仪(型号：Sonos 5500，惠普公司)；荧光酶标仪(型号：K3，赛默飞世尔公司)；透射电镜(型号：JEM-1230，JEOL电子株式会社)。SMY北京同仁堂科技发展股份有限公司；DOX为Sigma-Aldrich公司；HE染色试剂盒购自晶都生物技术有限公司；蛋白浓度测定试剂盒购自生工公司；BCL-2、Bax抗体购自CST公司；活性氧物质(ROS)荧光测定试剂盒购自杰美医药科技；细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司。

1.2实验动物分组 SPF级环境饲养健康雄性Balb/c小鼠(6～8 w，20～25 g)40只，随机分为四组(n=10)：①对照组(Control组)：生理盐水腹腔注射同时生理盐水灌胃；② DOX模型组(DOX组)：DOX 2 mg/kg腹腔注射，生理盐水灌胃，给药8 w；③DOX+SMY低剂量组(DOX+低SMY组)：建模并SMY按0.1 ml/kg每日灌胃给药；④DOX+SMY高剂量组(DOX+高SMY组)：建模同时予SMY 0.2 ml/kg每日灌胃。

1.3心功能检测 异氟醚麻醉小鼠，15 MHz小动物高频超声探头行心脏彩超。于乳头肌水平移动探头确保对齐左室长轴，采集清晰图像，测量心脏形态，计算左室舒张末期内径(LVEDD)，左室收缩末内径(LVESD)和左室射血分数(LVEF)。

1.4病理学检测 肝素灌洗心脏组织去除血块，10%中性甲醛过夜固定，剪至厚度2～3 mm，常规石蜡包埋切片(厚度约5 μm)、HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.5超微结构观察 2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1%锇酸固定，再次漂洗，酒精梯度脱水，包埋、固化、切片；3%醋酸铀-枸橼酸铅染色；透射电镜下观察超微结构形态。

1.6ROS含量检测 磷酸盐缓冲液(PBS)清洗心肌组织并制成组织悬液；稀释特异性荧光探针2′,7′-二氯荧光乙酰乙酸盐，滴加入组织悬液，37℃孵育30 min；期间每3～5 min混匀使探针和心肌组织充分接触，PBS洗涤除去残余探针，荧光酶标仪检测ROS荧光含量(激发波长：488 nm，发射波长：525 nm)。

1.7Western印迹法检测凋亡蛋白表达 提取心肌总蛋白Bradford法定量后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转印至PVDF膜上，并置于含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液中封闭非特异性结合位点，4℃过夜；TBST洗涤，Bcl-2和Bax一抗 4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h，ECL plus显色,凝胶成像系统行灰度扫描并分析，计算各蛋白与内参β-actin的比值作为相对灰度值，表示目的蛋白的相对表达水平。

1.8TUNEL法检测心肌凋亡指数 固定、封闭、通透、TdT反应、辣根过氧化物-链霉亲和素反应、二氨基联苯胺法显色、苏木素复染、盐酸酒精分化，自来水返蓝；酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张切片随机选取5个高倍镜视野，显微镜下观察并计数凋亡阳性细胞数(判断标准：阴性细胞即未发生凋亡的细胞，核染色为蓝色；阳性细胞即凋亡细胞，胞核染色呈深棕色或棕黄色颗粒)计算凋亡指数(AI)。AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1SMY改善心功能 ①与Control组相比较，DOX组(死亡1只)和DOX+低SMY组小鼠LVEF显著下降(P<0.01，P<0.05)，LVEDD和LVESD显著增大(均P<0.05)；DOX+高SMY组LVEF下降不具有统计学意义(P>0.05)；②与DOX组相比，DOX+低SMY组LVEF升高不显著(P>0.05)，而DOX+高SMY组LVEF显著提高，LVEDD和LVESD显著减小(均P<0.01)；③DOX+高SMY组较DOX+低SMY组LVEF显著升高，LVEDD和LVESD显著减小(均P<0.05)。见表1。

表1 SMY改善DOX引起的心功能障碍

与Control组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与DOX组比较:3)P<0.01；与DOX+低SMY组比较:4)P<0.05

2.2SMY减轻病理损伤 ①Control组心肌组织结构正常，排列整齐纹理清晰，核染色为蓝紫色；②DOX组较大部分心肌组织呈变性坏死，明显肿胀，核消失；细胞间隙增宽、心肌纤维有较多的局限性断裂，毛细血管充血扩张，密度显著增加，胶原及弹性纤维增生；淋巴细胞和炎性细胞浸润明显；③DOX+低SMY组心肌组织各部位有不同程度心肌变性、断裂、坏死及纤维化等病理损伤，较DOX组稍有好转；④DOX+高SMY组心肌病理改变仅局限在散在的心肌中，未见大范围变性坏死，改善较DOX+低SMY组更为明显，见图1。

2.3SMY改善超微结构改变 ①Control组心肌肌原纤维不明显，肌浆网稀疏，横小管和闰盘位于Z线水平，线粒体较为丰富，嵴排列整齐。②DOX组心肌超微结构损伤明显，横管与肌质网超微结构均有不同程度的损伤，肌小节减少和结构错乱，绝大部分线粒体肿胀、出现空泡、嵴断裂或外膜破裂。③DOX+低SMY组超微结构较DOX组稍有改善，但仍有较多的线粒体结构损伤。④DOX+高SMY组心肌超结构改善更为明显，线粒体嵴排列整齐，见图2。

图1 SMY减轻DOX所致心肌病理损伤(HE，×200)

图2 SMY改善DOX所致心肌超微结构损伤(×15 000)

2.4SMY减少ROS过度累积 ①与Control组〔(321.25±14.26)荧光密度/mg pro〕相比，DOX组〔(598.72±19.43)荧光密度/mg pro〕小鼠心肌组织内ROS荧光含量显著升高(P<0.01)；②DOX+低SMY组〔(431.22±15.26)荧光密度/mg pro〕和DOX+高SMY组〔(339.31±12.24)荧光密度/mg pro〕较DOX组〔(598.72±19.43)荧光密度/mg pro〕ROS荧光强度显著减弱(均P<0.05)。③而DOX+高SMY组〔(339.31±12.24)荧光密度/mg pro〕较DOX+低SMY组〔(431.22±15.26)荧光密度/mg pro〕ROS荧光强度减弱更为显著(P<0.05)。

2.5SMY降低凋亡相关蛋白的表达 ①促凋亡蛋白Bax表达水平比较，DOX组(0.35±0.03)较Control组(0.17±0.01)显著升高(P<0.05)，而DOX+低SMY组(0.21±0.03)和DOX+高SMY组(0.19±0.02)与Control组(0.17±0.01)无显著差别(均P>0.05)；DOX+低SMY组(0.21±0.03)和DOX+高SMY组(0.19±0.02)比DOX组(0.35±0.03)显著降低(均P<0.05)。②抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平相比较，DOX组(0.29±0.03)较Control组(0.41±0.02)显著降低(P<0.05)，而DOX+低SMY组(0.39±0.02)和DOX+高SMY组(0.38±0.04)与Control组(0.41±0.02)无显著差异(均P>0.05)；DOX+低SMY组(0.39±0.02)和DOX+高SMY组(0.38±0.04)均比DOX组(0.29±0.03)显著增高(均P<0.05)(见图3)。

1～4：Control组、DOX组、DOX+低SMY组、DOX+高SMY组图3 SMY降低凋亡相关蛋白的表达

2.6SMY延缓心肌凋亡 ①DOX组〔(66.59±3.27)%〕和DOX+低SMY组〔(61.35±4.02)%〕较Control组〔(23.37±2.56)%〕AI显著增高(均P<0.01)；DOX+高SMY组〔(26.11±2.79)%〕与Control组〔(23.37±2.56)%〕无显著差异(P>0.05)。②DOX+低SMY组〔(61.35±4.02)%〕与 DOX组〔(66.59±3.27)%〕，AI无显著差异(P>0.05)；DOX+高SMY组较DOX组和DOX+低SMY组AI均显著降低(均P<0.05)。见图4。

图4 SMY缓解DOX诱导的心肌凋亡(DAB，×200)

3 讨 论

蒽环类化疗药物在多重细胞分子机制的影响下产生心肌毒性损伤〔4〕，研究较多的学说为：①超氧自由基损伤学说：其在体内代谢产生的超氧自由基导致心肌细胞发生氧化应激损伤；②钙离子超载及能量代谢障碍学说；③细胞凋亡学说：通过线粒体途径、Fas/Fas L途径、丝裂原活化蛋白激酶途径、P53 途径、转录因子GATA-4途径、神经酰胺信号通路，导致心肌过度凋亡；④自噬学说〔5〕。SMY治疗多种心脏疾病疗效确切，能有效缓解患者呼吸困难、乏力、下肢水肿等典型症状，减缓心室重塑，改善心功能，提高左室舒张能力〔6〕。体内外实验研究显示，SMY通过抗氧化、抑制心肌纤维化、抗凋亡、改善心肌缺血〔7,8〕等机制对心肌损伤起保护作用。

现代药理研究结果表明，SMY主要有效成分为人参、麦冬、五味子。人参中主要成分人参皂苷Rb1和Rg3通过抗氧化、减少钙超载、稳定线粒体膜电位、抑制细胞凋亡和自噬，拮抗DOX导致的心肌损伤，保护心血管系统〔9,10〕。麦冬主要成分麦冬皂苷D通过减轻内质网应激及缓解DOX诱导的自噬保护心肌〔11,12〕。五味子主要成分五味子乙素能通过MAPK/P53信号通路，抑制DNA损伤，通过抗炎抗氧化抑制DOX诱导的心肌功能障碍〔13〕。本实验研究结果说明，SMY能明显缓解蒽环类药物引起的亚细胞器病理损伤，改善心肌结构；缓解心肌收缩力下降和心功能障碍。同时，明显降低ROS过度累积，显著缓解过氧化损伤。并且，降低促凋亡蛋白表达水平，增加抗凋亡蛋白的表达，减缓心肌过度凋亡，改善心功能。