杜爱林 姚良雪 崔展阁 秦浩志 韩家鑫 任静茹 张瑞岭

(1新乡医学院第二附属医院 河南省生物精神病学重点实验室，河南 新乡 453003；2新乡医学院生理学与神经生物学教研室 中英脑功能损伤联合实验室 河南省高校脑研究重点实验室培育基地)

酒精具有脂溶性和神经亲和力，可迅速通过神经细胞膜及血脑屏障〔1〕，脑组织是酒精重要的靶器官，最易受到伤害。研究表明,酒精中毒可能涉及的神经解剖部位包括海马、杏仁核等。酒精引起的脑功能损害在海马中较为显著〔2〕，可抑制海马部位神经元的成熟分化，从而造成学习记忆功能失调〔3〕。并有研究证实，杏仁核在酒精所致焦虑行为中起主要作用〔4〕，在正常生理浓度范围的硫化氢(H2S)可以扩张血管，提高学习记忆水平〔5〕，内源性H2S浓度升高到一定水平，便对细胞产生毒性损伤作用〔6〕。慢性酒精中毒可激活胱硫醚-β-合成酶(CBS),催化H2S的大量形成〔7〕；氨基羟乙酸(AOAA)是CBS活性抑制剂，可使H2S含量减少，缓解慢性酒精中毒导致的神经细胞损伤〔8〕。本实验观察AOAA作用于慢性酒精中毒大鼠后海马杏仁核内H2S和CBS的含量及大鼠学习记忆能力的变化，探讨AOAA对慢性酒精中毒大鼠组织损伤和行为的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物和分组 清洁级健康SD雄性大鼠60只(由新乡医学院动物中心提供),3～4周龄，体重120～60 g。实验开始前大鼠于22～25℃实验室中适应性饲养4～6 d，随后随机分为正常对照(NC)组、慢性酒精中毒模型(M)组、AOAA治疗(AR)组各20只。

1.2主要仪器和试剂 Morris水迷宫和行为学记录软件EthoVision XT 8购于德国Noldus公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，链霉卵白素工作液,山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G聚合物,封闭用正常山羊血清工作液，由北京中杉金桥生物技术有限公司生产；Bio-TekELx800全自动酶标仪购自美国Bio-Tek公司；AOAA购自美国ACROS公司；微量加样器购自德国Eppendorf公司；高速冷冻离心机购自德国Heraeus公司；FA1004电子分析天平购自上海泸奥明科学仪器有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯级。

1.3模型制作和处理 除NC组外，其余组复制慢性酒精中毒动物模型，把酒精与纯净水混合配成含体积分数为 6%(V/V) 酒精的水溶液作为唯一饮水来源， 24 h自由饮用， 室温控制在22～25℃，酒精溶液每日9∶00进行配制，置换，任意进食。14 d后，把AOAA按5 mg/kg比例溶解在1 ml的生理盐水中，每日腹腔注射1次，AR组注射剂量为5 mg/kg，NC组注射1 ml的生理盐水，持续注射14 d。

1.4学习记忆能力评价 实验前1 d，检测游泳能力，剔除游泳能力极差的。剩下的每组随机选16只进行水迷宫实验。训练前，一个平台被淹没在水面以下0.5 cm，控制水温在18.0～22.0℃，进行定位航行试验。实验时长4 d，每天相同时间点进行实验，记录游泳轨迹，并进行信号的记录与分析。每只每天训练4次，每个象限1次。每次训练60 s,若在60 s内找到水下平台，让其停留在平台上30 s,以巩固其记忆，若60 s内没有找到水下平台，则将其引导至水下平台停留30 s，让其根据4个象限不同的参照物进行空间学习记忆。定位航行实验结束后进行空间探索实验，该实验只进行1次，目的是测量在空间位置记忆形成后的定位保持能力。此次实验将水下平台移除，在原平台所在象限的对侧分别释放大鼠，每组游泳时长均为300 s，在规定时间内，检测穿越平台次数和平台所在象限游泳距离的比重。水迷宫实验最后1 d，处死大鼠，每组随机抽取8只进行免疫组化实验，剩余8只测定海马杏仁核H2S。

1.5海马H2S含量的测定采用亚甲基蓝分光光度法 将海马杏仁核组织置在-20℃温度下用研磨管充分研磨，后倒入5 ml的玻璃试管内，用放在冰中预冷的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=8.0)匀浆(1.2 g/L)，4℃下12 000 r/min离心10 min，离心后吸取0.1 ml的上清液，转至另一个离心管中，室温下，向其加入0.5 ml 1%的醋酸锌溶液，振荡混匀，孵育10 min，再依次向其加入0.5 ml 20 mmol/L的N，N-二甲基苯二胺溶液和0.5 ml 30 mmol/L的三氯化铁溶液，室温下孵育20 min使其充分显色，再加入2.5 ml三蒸水和1 ml 10%的三氯乙酸终止反应，进而离心(6 000 r/min，4℃，10 min)，取出其清澈的上清液，Bio-TekELx800全自动酶标仪测定波长670 nm处上清液的吸光度，依据H2S标准曲线计算出溶液中H2S含量，用单位重量组织H2S的量表示海马和杏仁核组织中H2S的含量。

1.6免疫组化观察海马杏仁核CBS表达 各组依次进行4%多聚甲醛(4℃) 灌注，断头取脑，固定，石蜡包埋和切片，石蜡切片需要脱蜡和水化，目的是让抗体等其他的试剂能够充分地与组织中抗原结合，使其发生反应，再使用水浴抗原修复法进行抗原修复，暴露出抗原决定簇，使用3%的H2O2去离子水清除内源性过氧化物酶活性。之后，加入试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)封闭非特异性蛋白进行一抗孵育，再加入试剂B(SP-0023：生物素标记山羊抗兔IgG)进行二抗孵育，进而加入试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，进行DAB显色，最后进行常规脱水、透明、中性树胶封片，通过显微镜观察双侧海马、杏仁核并且摄片。

1.7统计学分析 采用SPSS13.0软件进行配对t检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组学习记忆成绩 与NC组相比，M组学习和记忆能力明显降低,表现为第2～4天潜伏期和游泳距离的显著增多(P<0.01)；与M组相比，AR组潜伏期和游泳距离明显减少,第2～4天有极显著性差异(P<0.01)。 见表1。

表1 各组学习记忆能力

与NC组比较：1)P<0.01；与M组比较：2)P<0.01；下表同

2.2光镜观察各组海马组织、杏仁核组织中CBS表达 各组海马组织、杏仁核组织均可见一定量CBS表达。与NC组相比，M组CBS含量显著升高(P<0.01)；与M组相比，AR组CBS含量显著降低(P<0.01)。见表2、图1。

表2 各组海马组织、杏仁核组织中CBS平均光密度值

NC组海马组织

M组海马组织

M组杏仁组织

AR组杏仁组织

2.3各组海马组织、杏仁核组织中H2S的含量 与NC组相比，M组海马组织、杏仁核组织内的H2S含量明显增高(P<0.01)；与M组相比，AR组海马组织、杏仁核组织中H2S含量均显著降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组海马组织、杏仁核组织中H2S含量

3 讨 论

慢性酒精中毒发病率在全球病死和致残的危险因素的排名中位列第3〔9〕。长期大量饮酒可引起中枢神经系统的广泛性损害〔10〕。脑海马区是调控学习记忆功能的结构基础。杏仁核具有情绪调控和场景相关记忆的建立功能〔11〕。杏仁核中外侧核(LA)是产生长时程增强效应(LTP)记忆的重要位置〔12〕，双侧杏仁核海马均增强情绪记忆效应，这种固化增强作用是情绪信息由杏仁核作用于内侧颞叶记忆系统，进一步调节记忆固化作用——情绪调节假说〔13〕。当条件刺激LA，会产生LTP，若含有场景信息，则会与海马产生关联，进而在海马内诱导LTP，产生相对稳定的场景情绪记忆；同时海马也可以通过刺激杏仁核内基底核、附属基底核来调节信息传递〔14〕。以往实验证实在LA和海马内加入蛋白质合成阻断剂可阻碍记忆的巩固，说明杏仁核可以巩固海马的记忆〔15〕。

Morris水迷宫是一种研究海马功能相关的空间学习记忆模型〔16～18〕。测试逃避潜伏期、游泳距离等指标〔19〕，能探究动物对空间方向感和位置感的记忆和学习能力〔18〕。本研究提示酒精中毒模型大鼠空间学习记忆能力降低。而给予AOAA对慢性酒精中毒大鼠的记忆认知功能有明显的改善作用。

H2S是继一氧化氮和一氧化碳之后的第3类气体信号分子〔20〕，具有神经保护效应和生物学效应〔21，22〕，与学习记忆过程和情绪调控相关〔23， 24〕。生理浓度的 H2S能易化海马LTP来调节海马依赖的情景型恐惧记忆和新物体认知能力〔23〕，杏仁核制造并调节情绪学习和记忆〔25，26〕。此外 H2S主要在CBS的催化下以 L 型半胱氨酸和高半胱氨酸为底物生成〔27〕。CBS的表达及活性直接关系脑内 H2S水平〔28〕。慢性酒精中毒可以激活CBS,催化H2S的大量形成。本研究显示AOAA可能通过抑制CBS活性减少脑内H2S的生成。