李彦霖，谭思然，何丽雯，曹科，张倩，谭冬梅，谭毅

(重庆医科大学实验动物中心，重庆 400016)

音乐构成要素复杂，不同频率音乐刺激对动物将会产生不同的生物效应[5]。音乐频率对人体自主神经系统具有调节作用，研究表明高频段音乐和低频段音乐相比，高频段音乐缓解女大学生焦虑的效果更好[6]。不同频率的音乐对动物影响也存在差异，高频音乐能提高断奶仔猪的日增重量及饲料转化率，低频音乐次之，中频音乐不明显[5]。频率这一物理特性对于音乐刺激的效果存在进一步的研究价值。目前关于不同频率音乐对小鼠抑郁模型行为学影响的研究基本处于空白。本研究选取莫扎特K448奏鸣曲进行音频处理，过滤保留高频段部分，初步探究其改善小鼠抑郁症状的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重20～25 g，来源并饲养观察于重庆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证和使用许可证分别是【SCXK(渝)2017-0001】、【SYXK(渝)2017-0023】。实验方案已获得重庆医科大学医学伦理委员会审批通过。

1.1.2 实验仪器及试剂

山水(SANSUI)A38S迷你插卡小音箱(山水电子有限公司)、小鼠自主活动测试仪(成都泰盟科技有限公司)、泰仕声量计(台湾泰仕电子工业股份有限公司)、微量离心机(Thermo Scientific，美国)、酶标仪(Thermo Scientific，美国)、HDR-XR150E数码相机(Sony，日本)、Adobe Audition CC 2014、SMART3.0视频行为学分析软件。盐酸氟西汀(大连美仑生物制药有限公司，CAS号：56296-78-7)、小鼠脑源性神经营养因子ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 音乐选取

将莫扎特K448奏鸣曲进行音频处理，按照美国音乐期刊The Absolute Sound与 Stereophile所确立的标准过滤为高频段。音频处理软件为Adobe Audition CC 2014，处理方式为频段分离。频谱分析如图1。

3.评价指标权重和分值。考评内容比较全面准确地反映出一个工程科技人员的能力和业绩现状，较好地体现了国家和中国石化有关工程技术职务条例和对晋升各级职务的要求。根据多年职称评审工作实践总结，结合工程技术职务自身特点，笔者认为，按照5∶5的比例确定定性和定量部分所占比重较为合理，按总分数由高到低依次排列参评人员顺序。具体分值和权重情况如表1所示。

注：A，正常音乐频谱；B，过滤之后保留的高频段音乐频谱(6000 Hz以上)。图1 音乐的频谱分析Note. A. Frequency spectrum of the normal music. B. High-frequent spectrum of the music (above 6000 Hz).Figure 1 Frequency spectrum analysis of the music

1.2.2 小鼠造模方法

C57BL/6小鼠于实验前适应性饲养3 d，采用自主活动测试进行初步筛选，将后3 min内水平活动大于120次或小于30次的予以剔除。符合要求的小鼠共分为两组，空白组和实验组，其中空白组10只，模型组36只。实验采用慢性轻度应激建立模型[7-9]，为避免小鼠对单一或有规律的应激刺激产生耐受性，本实验采取多种不可预知的刺激方式交替进行。刺激方式结合参考文献及具体实验条件确定，包括束缚(4 h)、禁食(24 h)、禁水(16 h)、昼夜颠倒、噪声刺激(1 h)、夹尾(5 min)、湿垫料(24 h)、热水游泳(5 min)、冷水游泳(5 min)、鼠笼倾斜(24 h)10种。除空白组外，其余小鼠每天随机安排三种应激刺激，并持续5周。在此期间，保持每种刺激在各组内最少出现8次。

1.2.3 干预措施

造模成功后，模型组随机均衡分为模型对照组、氟西汀组和音乐组，每组12只。空白组：保持安静的生活环境，充足的饮食饮水，正常的昼夜节律。模型对照组：继续每天8：00时开始给予慢性温和不可预知刺激，共2周，同时每天腹腔注射生理盐水。氟西汀组：每天腹腔注射盐酸氟西汀溶液(10 mg/kg)，同时继续慢性温和不可预知刺激。音乐组：每天15：00～17：00时在笼盒中播放调制好的莫扎特K448高频段声波，音量保持在60～70 dB(2 h/d)，同时继续慢性温和不可预知刺激并注射生理盐水。

1.2.4 体重及行为学实验

(1)体重：实验前3 d及实验中每周(共7周)称量体重并记录。称重在17：00～19：00时进行。

(2)自主活动测试：自主活动测试主要用于正式实验前的动物筛选。测试环境为分离反应箱，配有相应的微电脑控制系统，每次可测试6只小鼠，测试时间为5 min，统计后3 min中的活动以及站立次数。每次测试完毕后，用75%乙醇充分清洁黑箱，避免气味产生干扰。

(3)悬尾实验(tail suspension test，TST)：悬尾实验能反映动物的“失望”情绪及 “抑郁”状态，用于观察小鼠为克服不正常体位而进行挣扎的体力及心理疲劳程度，是较为经典的反映小鼠心理抑郁程度的行为学评定方法。实验在暗光、无噪声的环境下进行，将小鼠的尾端用胶带固定悬挂，小鼠尾尖距地面30 cm左右。每只小鼠单独接受悬尾实验，以防相互干扰。实验持续6 min，用数码相机记录实验过程，使用SMART 3.0 视频行为学分析软件统计后4 min内小鼠不动总时间。悬尾实验在第1周(造模开始前)、第5周末(即造模成功后)和第7周末(即音乐组干预完成后)进行。

(4)强迫游泳实验(forced swimming test，FST)：强迫游泳实验为小鼠提供了一个不可回避的环境，让它们处于压迫状态，一段时间后，小鼠表现出“行为绝望状态”。每只小鼠在实验前24 h进行15 min的适应性游泳。泳桶高30 cm，直径15 cm，内装20 cm高的清水，水温保持在25℃左右。左手托住小鼠，右手轻轻将其放入水面。实验持续5 min，用数码相机记录实验过程，使用SMART 3.0视频行为学分析软件统计后4 min内小鼠不动总时间。强迫游泳实验在第1周(造模开始前)、第5周末(即造模成功后)和第7周末(即音乐组干预完成后)进行。

1.2.5 小鼠脑组织中脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)含量测定

第7周末行为学实验结束后，迅速将各组小鼠颈椎脱臼处死。在冰袋上剪开头皮，打开颅腔取出脑组织，剔除小脑后称重，用冰冷的生理盐水冲洗并用滤纸吸干，放入冰下的匀浆管中。按照1∶9的比例加入冰冷的生理盐水，充分研磨，形成10%的组织匀浆液。将制备好的组织液放入4℃离心机中以2500 r/min离心10 min，取上清液，放入-80℃冰箱待用。采用ELISA法进行BDNF测定，严格按照试剂盒中说明书进行操作。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 实验小鼠的体重变化趋势

重复测量方差结果显示(图2)，处理效应与时间的交互作用有统计学意义(F=23.695，P< 0.01)。处理主效应有统计学意义(F=5.674，P< 0.01)，各组小鼠体重变化不完全相同。造模前3 d，各组小鼠体重基本一致，差异无显著性(P> 0.05)，基线具有可比性。造模第1周，接受了慢性温和不可预知刺激的模型组小鼠，体重基本没变，随后有一定程度的增加，但在造模4周末，模型组小鼠体重明显低于空白组(P< 0.05)，在第5周，模型组的体重出现明显增加。治疗的第2周(即实验第7周)，与模型对照组相比，氟西汀组和音乐组的体重有一定程度的增加。

图2 各组小鼠在造模和治疗过程中的体重变化Figure 2 Body weight of the mice at baseline and 7 week later

图3 抑郁造模的行为学评价Figure 3 Behavioral evaluation of the CUMS mouse models

2.2 慢性温和不可预知刺激(chronic unpredictable and mild stress, CUMS)模型评价

如图3所示，应激后小鼠表现为活动迟钝，兴趣丧失和快感缺乏。方差分析表明，第5周后模型组的行为学实验结果与空白组相比存在显著差异，提示造模成功。模型组和空白组的悬尾实验的不动时间分别是(147.28 ± 24.29)s、(124.37 ± 13.03)s，不动时间显著延长(P< 0.01)。模型组和空白组的强迫游泳实验的不动时间分别是(161.47 ± 18.40)s、(143.89 ± 19.95)s，不动时间也显著延长(P< 0.05)。

2.3 各组干预效果

如图4所示，模型对照组第7周的悬尾不动时间和强迫游泳不动时间，较第5周均无明显差异(P> 0.05)，提示慢性温和不可预知刺激保持了小鼠的抑郁状态。第7周与第5周相比，氟西汀组悬尾不动时间降低，差异具有显著性(P< 0.01)，强迫游泳不动时间降低，但差异不具有显著性(P> 0.05)；音乐干预组悬尾不动时间降低，差异具有显著性(P< 0.05)，强迫游泳不动时间无明显变化。

图4 音乐干预效果的行为学评价Figure 4 Behavioral evaluation of the music intervention

2.4 脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)含量测定结果

行为学实验结束后，通过ELISA法检测各组小鼠脑组织中的BDNF的含量，BDNF标准品回归方程y=0.0011x + 0.1035，线性范围31.25～500 pg/mL, 相关系数r2=0.9449。结果发现(表1)，模型对照组与空白组小鼠相比，脑组织匀浆中的BDNF含量降低，差异具有极显著性(P< 0.01)；氟西汀组较模型对照组，BDNF含量极明显回升(P< 0.01)，较空白组无差异(P> 0.05);音乐组的BDNF含量较模型对照组有增加，但其差异无显著性。

表1 各组脑组织匀浆BDNF含量检测结果与比较Table 1 Comparison of the BDNF content in brain tissue of

注：**P< 0.01，与空白组相比。##P< 0.01，与模型对照组相比。

Note.**P<0.01vs. the blank group.##P< 0.01vs. the control group.

3 讨论

抑郁症是一种以情绪低落为主要特征的精神障碍，涉及到多种病理生理过程。由于其复杂性，病因机制尚未明确。目前研究中抑郁症的动物模型主要分为药物诱发模型、孤养模型、转基因模型和CUMS模型等。1981年，Katz等[10-11]模拟抑郁症诱因首次建立了CUMS模型，即将动物长时间置于一系列慢性温和不可预知刺激中，从而模拟人类在长期生活中遭受的慢性低强度刺激，刺激的多样性和不可预知性是造模成功的关键。相比于其他模型，CUMS模型的性状可以更加接近人类抑郁症，故被广泛应用于抑郁症研究中[12]。然而，目前对刺激类型、方式、强度、持续时间及造模周期，并没有一个统一的标准，且在CUMS造模过程中，需要各种不同的应激方式不定时地对小鼠进行刺激，不仅过程繁琐，周期过长，耗时费力，还可能存在动物抑郁表现不稳定的情况。因此，在模型的建立和应用过程中，对模型进行评价显得至关重要。

音乐是一种不仅限于艺术欣赏和审美领域的艺术形式，经过多年发展，已经逐步渗透到医疗、心理等领域，音乐治疗也成为了一门独立学科[13]。国内外已有很多音乐治疗的研究，在音乐选取上，多为莫扎特K448奏鸣曲或莫扎特钢琴曲[14]。研究表明，成年小鼠在接受连续30 d的莫扎特K448奏鸣曲刺激后，海马、大脑皮质基因表达受到显著影响[15]。出生后的早期音乐刺激，可增强大鼠NMDA受体介导的神经可塑性，使其在听觉分辨学习任务中听觉能力增强[16]。音乐的元素多种多样，频率作为其中一种重要的组成因素，目前已成为研究音乐治疗的一个部分。但现有的研究大都体现不同曲目的不同频率的差异，混杂因素较多。本研究在前期研究的基础上[17-18]，通过频段过滤，去除了节奏、音色等因素的影响，并结合啮齿类动物200～ 90 000 Hz的声频范围[19]，选择莫扎特K448奏鸣曲中的高频段声波干预抑郁小鼠，初步探究其改善小鼠抑郁症状的效果。

已有动物实验证明，啮齿类动物在遭受长期应激后，会出现体重降低的现象。本实验中也发现，接受慢性应激的模型组小鼠较空白组的体重增长明显变缓。但在造模的第4、5周，模型组小鼠出现体重增长明显加快的短暂时期，这可能与小鼠对应激刺激的暂时适应有关，这也与我们观察到的，在造模第4周小鼠抑郁状态出现短暂的恢复相一致。因此我们在第5周末对小鼠的抑郁状态进行了行为学评价，并给予了不同的干预。经过氟西汀和音乐干预2周后，此两组小鼠的体重较模型对照组出现上升趋势，提示药物和音乐改善了小鼠的抑郁状态。

目前，行为学评价是判定抑郁症模型的主要标准[20]。常见的行为学实验有糖水消耗与偏好实验、旷场实验、高架迷宫实验、水迷宫实验、悬尾实验和强迫游泳实验。其中旷场实验和高架迷宫实验主要用于评价动物的焦虑状态，水迷宫实验主要用于评价空间学习记忆能力。糖水消耗与偏好实验、悬尾实验和强迫游泳实验通过表面效度(抑郁样表型改变)评价抑郁模型。本次实验中选取悬尾实验和强迫游泳实验对造模是否成功及干预是否有效进行评价，接受慢性温和不可预知刺激的模型组小鼠与空白组相比，悬尾不动时间及强迫游泳不动时间显著延长，证实了慢性温和不可预知刺激造模的有效性。与第5周(即造模成功后)相比，第7周(即干预结束后)氟西汀组悬尾实验及强迫游泳实验不动时间均减少，证实了药物治疗的有效性，而音乐组悬尾实验不动时间减少，说明音乐在一定程度上具有缓解抑郁作用，但强迫游泳实验不动时间变化不明显，可能与强迫游泳实验反映抑郁的敏感性或者样本数量有关。

BDNF与神经生长因子、神经营养素来源于同一基因家族[21]。作为一种最为常见的神经营养因子，BDNF在神经细胞的生长发育、损伤修复中发挥重要角色。另外，BDNF和5-羟色胺能神经元之间可互相调节达成动态平衡。研究表明BDNF可通过5-羟色胺能神经系统与抑郁相关[22]。BDNF免疫阳性神经元广泛分布在脑内，包括大脑皮层、海马齿状回、黑质纹状体、下丘脑、小脑、中脑顶盖区、脑干等，其中以海马齿状回和皮层的含量为最高。抑郁症患者通常会出现海马体积缩小，BDNF含量降低[23]。实验室动物模型表明海马神经的减少和抑郁行为之间存在关联[24]。本研究模型对照组脑组织BDNF含量明显低于空白组，可进一步说明CUMS造模有效。氟西汀组含量明显高于模型对照组，可反映药物治疗的有效性。但音乐组脑组织BDNF含量虽高于模型对照组，但差异并无显著，可能与音乐干预起效较慢、治疗时间不够长，样本数量较少和个体差异等有关，还可能是单纯的音乐干预无法达到预期效果，需要与药物配合才能更好地发挥作用，此需要进一步的研究。

综上所述，本研究成功构建了CUMS抑郁小鼠模型，发现莫扎特K448奏鸣曲的高频段声波对改善抑郁模型小鼠行为学有积极效应，为优化抑郁症的治疗方法提供了线索，同时也为音乐在动物福利中的应用提供了思路。