赵晨，赵娇，赵晓波，白燕，金润铭

(华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科，武汉 430022)

支气管哮喘是由多种细胞如嗜酸性粒细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。是环境因素作用于遗传易感个体，在炎症细胞、细胞因子炎症介质的相互作用下所导致的气道炎症和气道高反应性。大量研究表明哮喘的炎症反应与气道一系列炎症细胞浸润有关，而这些炎症细胞在很大程度上受Th2型淋巴细胞活化的驱动。有研究表明在支气管哮喘病人的呼吸道中，Th1和Th2细胞比例是失衡[2]。Th2主要分泌的IL-4、IL-5细胞因子，IL-4对于IgE的产生发挥重要作用。Th1细胞分泌IFN-γ抑制嗜碱性粒细胞，肥大细胞和嗜酸性粒细胞的增殖和分化。

另外，研究显示氧化应激在哮喘的发病机制中发挥重要作用[3-5]，如气道“自由基损伤”、“氧化/抗氧化失衡”学说。过度的活性氧自由基/活性氮自由基的产生会造成气道炎症、气道高反应性、气道微血管高通透性和气道黏液高分泌，以及组织损伤和形态的改变[6]。减轻氧化应激或增加抗氧化能够减轻气道嗜酸粒细胞浸润，减少黏液分泌，从而缓解支气管哮喘[7-8]。

复方太子参止咳益气散(TZY)能够缓解支气管哮喘[9]，其是否是通过抗炎和抗氧化机制来改善支气管哮喘症状尚不为人所知。本文通过给予支气管哮喘动物模型不同剂量的TZY，探讨其缓解症状的机制，为TZY在临床的使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6～8周龄雄性SD大鼠70只，购于辽宁长生生物技术股份有限公司【SCXK(辽)2015-0001】，实验动物均饲养于华中科技大学同济医学院动物实验中心SPF级环境【SYXK (鄂) 2015-0035】，实验动物伦理编号为安评中心动(福)第HK2018001号。

1.1.2 试剂与仪器

卵白蛋白(OVA，美国Sigma公司)；普米克令舒(批号：1010429850，规格： 2 mL:1 mg, AstraZeneca Pty公司)；TZY(批准文号：国药准字B20170004，武汉贝参药业股份有限公司)。致敏液配制：将OVA溶于新鲜配制的10% Al(OH)3溶液中，充分搅拌混匀，使OVA的终浓度为0.2%。注意混悬液制备后为保证致敏效果应于1 h内使用。雾化液配制：将OVA与0.9% NaCl溶液搅拌使其混合均匀，使OVA的终浓度为1%。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

将SD雄性大鼠随机分为7组，分别为对照组，哮喘模型(OVA诱导)组，低剂量TZY灌胃+哮喘模型组，中剂量TZY灌胃+哮喘模型组，高剂量TZY灌胃+哮喘模型组，普米克令舒雾化+哮喘模型组，普米克令舒雾化+TZY灌胃+哮喘模型组。

1.2.2 哮喘模型的建立

通过卵白蛋白(OAV)致敏并激发建立哮喘模型。致敏：第1和8天采用传统的十点致敏法[10]，包括两前后足趾4点，两侧腹股沟2点，颈部1点，背部左、中、右3 点，每点皮下注射0.05 mL OVA 凝胶，另腹腔注射0.5 mL OVA凝胶，OVA 致敏总体积为1 mL/只。激发：第14天至第21天，将大鼠置于密闭容器中并以1%OVA溶液雾化30 min/d。(对照组给予生理盐水做对照，其余各组制备哮喘模型)。

1.2.3 各组给药方式

各组均在激发前1～2 h进行干预。TZY：小剂量1.25 g/kg，中剂量为2.5 g/kg，大剂量为5 g/kg。用生理盐水配置成2～3 mL，每天一次灌胃。普米克令舒组给予普米克令舒雾化，1 mg/只，每天一次。对照组给予生理盐水，每天一次。所有干预均于激发前30 min完成。

1.2.4 标本的获取

将大鼠进行颈椎脱臼处死。用0.5 mL盐水灌洗大鼠支气管肺泡4次，肺泡灌洗液(BALF)1200 r/min离心5 min，4℃，上清液保存在-20℃保存备用。

1.2.5 病理学观察

取大鼠近肺门处的左肺组织，在4%的多聚甲醛中进行固定约4～6 h，进行常规的石腊包埋及切片，以行染色检测。将制备好的切片常规固定、脱水，以进行HE染色，用来观察气道的病理学改变。

1.2.6 流式细胞术

收集大鼠主动脉外周血, 制备单个核细胞悬液后，加入流式抗体，Th1细胞用CD4/IFN-γ标记，Th2细胞用CD4/IL-4标记。CD4抗体带有APC标记(APC Mouse anti-rat CD4，货号17-0040-82，Invitrogen厂家提供)，IFN-γ抗体带有FITC标记(FITC Mouse anti-rat IFN-γ，货号559498，BD厂家提供)，IL-4抗体带有PI(PE)标记(PE Mouse anti-rat IL-4，货号555082，BD厂家提供)。充分混匀后室温避光孵育30 min，上机检测大鼠外周血中淋巴细胞的百分率。

1.2.7 生化检测

试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，购得GSH试剂盒(货号A006-2)、T-AOC试剂盒(货号A015-2)、MDA试剂盒(货号A003-1)、SOD试剂盒(货号A001-3)，按照试剂盒说明书进行操作。根据标准曲线计算GSH、T-AOC、MDA、SOD的浓度。

1.2.8 ELISA检测

将获取的每组大鼠BALF使用IL-4、IL-5、IgE、IFN-γ ELISA试剂盒(R&D Systems)来测定各组细胞因子的浓度，按照说明书进行操作。根据标准曲线计算各组细胞因子的蛋白浓度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 病理观察结果

病理切片经HE染色后，对照组可观察到肺泡结构正常，肺泡腔内无渗出液，间隔无增宽，肺泡上皮细胞排列有序，肺泡壁厚度正常，无炎性细胞浸润。哮喘模型组光镜下可观察到肺泡壁结构受损，肺泡壁增厚，支气管腔狭窄，大量黏膜上皮细胞脱落，支气管与血管周边疏松水肿及纤维化形成，支气管上皮杯状细胞化生，支气管与血管周围重度炎性细胞浸润，可见增生的淋巴滤泡。TZY中剂量组可见肺泡腔较模型组变大，支气管腔未见脱落的上皮细胞，支气管壁水肿程度减轻，炎性细胞浸润程度明显降低，可见部分增生的淋巴滤泡，腔内出血，较多渗出物红染。TZY高剂量组可见部分肺泡壁增厚，支气管腔狭窄程度有所减轻，部分支气管与血管周边疏松水肿及纤维化形成，炎性细胞浸润区域明显减少。TZY和普米克令舒联用组可见支气管管腔未见明显狭窄，肺泡间隔较薄，肺泡腔变大，肺泡区炎性细胞浸润明显减少(图1)。

2.2 Th淋巴细胞的比例比较

由图2、图3可知，通过对不同组别的分析，我们发现给予哮喘大鼠TZY中剂量组和高剂量组灌胃，均可以明显提高外周血Th1细胞比例，降低Th2细胞比例(P<0.05)，其中TZY中、高剂量组与普米克令舒雾化组相比较，Th1/Th2细胞比例上调，两组无显著差异(P>0.05)。联用普米克令舒雾化和TZY灌胃，Th1细胞上升，Th2细胞下降，Th1/Th2细胞比例上调作用与单用低剂量TZY灌胃或单用普米克令舒雾化相比，都更为显著(P<0.05)，说明TZY和普米克令舒雾化有叠加作用。

2.3 细胞因子水平的变化

与对照组相比，哮喘组BALF IL-4、IL-5、IgE水平明显增加(P< 0.05)；与哮喘组比较，中药组BALF IL-4、IL-5、IgE的蛋白水平显著降低(P< 0.05)，且随着中药浓度的增加，其蛋白水平降低更显著。普米克令舒组和高剂量中药组BALF IL-4、IL-5、IgE的蛋白水平无显著差异。

与对照组相比，哮喘组BALF IFN-γ水平明显减少 (P< 0.05)；与哮喘组相比，中药组BALF IFN-γ水平显著增加 (P< 0.05)，且随着中药浓度的增加，其蛋白水平上升幅度更显著。普米克令舒组和高剂量中药组BALF IFN-γ的蛋白水平无显著差异。(图4)

注：A.对照组；B.哮喘组；C.TZY低剂量组；D.TZY中剂量组；E.TZY高剂量组；F.普米克令舒组；G.普米克令舒+TZY组。(下图同)图1 TZY对哮喘大鼠支气管肺组织病理的影响 (×200)Note. (A) control group (B) asthma group (C) low dose group of TZY (D) medium dose group of TZY (E)high dose group of TZY (F) Pulmicort respules group (G) group of Pulmicort respules and TZY. (The same in the following figures)Figure 1 Effect of TZY on bronchial histopathology in the asthmatic rats (×200)

注：与对照组相比差异有显著性，*P<0.05；与哮喘组相比差异有显著性，#P<0.05；与普米克令舒组相比差异有显著性，&P<0.05。图3 TZY对CD4+ IL-4+细胞水平的影响Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the asthma group,#P<0.05. Compared with the Pulmicort respules group,&P<0.05.Figure 3 Effect of the drugs on CD4+IL-4+ cells

注：与对照组相比差异有显著性，*P<0.05；与哮喘组相比差异有显著性，#P<0.05；与普米克令舒组相比差异有显著性，&P<0.05。图4 TZY对细胞因子表达的影响Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the asthma group,#P<0.05. Compared with the Pulmicort respules group,&P<0.05.Figure 4 Effect of TZY on the expression of inflammatory cytokines

2.4 氧化应激水平

相对于对照组，哮喘组GSH、T-AOC、SOD含量显著降低(P<0.05)；相对哮喘组，中剂量TZY、高剂量TZYGSH、T-AOC、SOD含量显著增加(P<0.05)。高剂量组和普米克令舒组之间GSH、T-AOC、SOD含量无显著性差异(P<0.05)。

相对于对照组，哮喘组MDA含量显著增加(P<0.05)；相对于哮喘组，中剂量TZY、高剂量TZYMDA显著减少(P<0.05)。高剂量组和普米克令舒组之间MDA含量无显著性差异(P<0.05)。(图5)

注：与对照组相比差异有显著性，*P<0.05；与哮喘组相比差异有显著性，#P<0.05；与普米克令舒组相比差异有显著性，&P<0.05。图5 TZY对氧化应激相关因子水平的影响Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the asthma group,#P<0.05. Compared with the Pulmicort respules group,&P<0.05.Figure 5 Effect of TZY on the levels of oxidative stress related factors

3 讨论

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病[1]，是儿童常见的喘息性疾病之一。由于儿童气道解剖结构、生理及免疫的特殊性，支气管哮喘在儿童中发生率较高。研究表明，约34%的儿童在3周岁之前出现过至少1次喘息，将近一半的儿童在6岁前会出现喘息[11]。支气管哮喘的发病机制主要包括气道炎症、气道高反应性、支气管痉挛和气道重塑几个方面。治疗支气管哮喘常用药物包括糖皮质激素、白三烯调节剂、支气管舒张剂、抗组胺药物等[12]。其中，吸入性糖皮质激素(ICS)是目前最强的气道局部抗炎药物，其通过对炎症反应相关的细胞和分子产生影响而发挥抗炎作用。

中医学理论将支气管哮喘归纳为“哮病”，该病属“吼病”、“痰饮”的范围，从中医外治法角度探究儿童哮喘的防治方法已成为国内众多学者的研究方向。目前常用的中医方法包括针灸治疗、穴位敷贴、穴位注射、敷脐治疗、推拿治疗、耳压治疗、灌肠治疗、雾化吸入治疗等，这些方法在治疗儿童哮喘方面均取得了较好的疗效[13]。

TZY是由太子参、冬虫夏草、浙贝母、天花粉、槟榔、白及、甘草等7味纯原生植物药整体组方。中医角度，TZY从根本上针对肾、脾两虚加以治疗。临床上治疗哮喘已得到广泛认可[5]。鉴于此，本文开展TZY治疗大鼠哮喘的作用研究。结果发现，与哮喘模型组相比，TZY可降低气道支气管细胞的炎性浸润，提示其具有良好的治疗哮喘作用。

炎症反应被认为是哮喘的可能发病机制之一，在哮喘发生和进展中发挥着重要作用[14-15]。IgE类抗体是引起支气管哮喘的主要效应分子之一。当变应原初次进入机体后,刺激B细胞增殖并分化为浆细胞，产生IgE类抗体，IgE可与嗜酸性粒细胞或肥大细胞表面的IgE Fc受体高亲和力结合，使机体致敏；当机体受到相同变应原再次刺激后，其与连接在嗜酸性粒细胞或肥大细胞表面的IgE交叉结合，导致受体交联，启动激活信号，从而导致嗜酸性粒细胞或肥大细胞活化和脱颗粒, 释放多种组胺、活性介质等引发I型变态反应[16-18]。同时有报道显示炎症因子IL-4、IL-5、IFN-γ可用于研究哮喘所致的炎症反应，与本文结果一致[19-20]。本文结果显示，TZY 组IL-4、IL-5、IgE水平显著降低，但IFN-γ水平显著升高 (P<0.05)，且呈剂量依赖性，提示TZY可以调节炎症细胞因子。此外，氧化应激是哮喘炎症发生发展的另一重要机制[21-22]。本文检测了哮喘大鼠TZY治疗后GSH、T-AOC、SOD及MDA表达，考察其氧化应激水平。结果发现，与哮喘组相比，TZY组GSH、T-AOC、SOD水平显著升高，MDA水平显著降低，提示该复方具有调节氧化应激的作用。

本文进一步研究了大鼠外周血不同Th细胞比例，Th1、Th2细胞是参与哮喘发生发展的主要免疫细胞，Th1/Th2比例可反应哮喘个体免疫紊乱程度及功能[23-24]。结果显示，TZY可下调Th2(CD4+IL-4+)细胞水平、上调Th1(CD4+IFN-γ+)细胞水平及Th1/Th2比例，提示TZY能调节哮喘大鼠免疫紊乱，提高免疫功能。

综上，TZY可通过调节炎症反应及氧化应激，提高机体免疫功能从而治疗大鼠哮喘，本文结果为进一步临床推广该复方(或和激素联合应用)治疗支气管哮喘奠定基础。