蒋学泉，张文云*，李娜，何武书，和丽佳，袁艳波

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院口腔科 昆明 650032；2. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，昆明 650118)

因外伤、肿瘤、牙周病及长期缺失牙等原因造成的颌面部骨缺损，严重影响患者的功能、外形和生活质量，需要通过植骨术来修复重建骨缺损[1]。然而常常因植骨术后继发感染而导致失败，如何在彻底控制感染的同时促进骨质的生长愈合，成为目前研究的热点[2]。Ripamonti等[3]发现Ca.P生物材料植入实验动物非骨部位的HA表面形成了类骨质，但以树鼩作为人工骨材料的实验动物目前还未见报道。本课题组前期制备得到多孔复合材料HAPw/n-ZnO，实验证明该复合材料有优良的抗菌能力和一定的成骨能力。本实验将多孔复合材料HAPw/n-ZnO植入树鼩背部肌肉内并通过大体观察、组织病理学等检测分析多孔复合材料HAPw/n-ZnO的生物学性能，为构建新型抗菌骨修复材料提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用12月龄清洁级树鼩15只，雌雄不限，体重120～140 g，无背部疾患，由中国医学科学院医学生物学研究所【SCXK(滇)K2013-0001】提供，在中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心【SYXK(滇)K2013-0001】完成动物实验。实验方案获得中国人民解放军第九二〇医院伦理委员会通过(2016009)。

1.1.2 试剂与仪器

多孔复合材料HAPw/n-ZnO(自制于昆明理工大学生物工程材料实验室)、Bio-Oss骨粉(瑞士 Geistlich集团)、法国ATLANTIK人工骨(法国)，金氏植骨灵(中国)ALP试剂盒、Masson染色试剂及苏木精-伊红染液均来自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的构建

将所有骨修复材料用60Co照射消毒，手术器械进行高温高压消毒，备用。树鼩术前12 h常规禁食，背部术区备皮，用质量浓度为6 g/L的戊巴比妥钠经肌肉注射0.1 mL麻醉，背部棘突正中5 cm长皮肤切口，切开皮肤及皮下组织，暴露肌肉组织，于背部肌间隙内以止血钳钝性分离，制成双侧背部肌袋模型，每侧两个肌袋，前后共四个肌袋，每个肌袋间前后距离6 cm，左右距离2.5 cm。分别植入多孔复合材料HAPw/n-ZnO、Bio-Oss骨粉、ATLANTIK人工骨和金世植骨灵各0.1 mL。人工骨材料植入后逐层缝合肌层及皮肤，缝合皮肤后碘伏消毒，术后常规分笼饲养。术后处理：(1)每只树鼩肌肉注射青霉素(10万U/d)，1次/d，共3 d；(2)术后进软食，10 d后拆线；(3)定期观察动物状态及伤口愈合情况。

1.2.2 实验分组

以四个不同的植入位点分为四组，多孔复合材料HAPw/n-ZnO组为实验组，其余三组为平行对照组。

1.2.3 标本处理

分别于术后4、8、12 周行质量浓度为6 g/L戊巴比妥钠1 mL麻醉后牺牲4 只树鼩。待树鼩心跳停止后，将其固定在手术台上，沿原手术入路切开皮肤，将植入材料及包裹材料的肌肉组织一并取出，取出部位肌肉大小为边长1 cm方形，厚度约0.5 cm。取出后行大体观察，剖开后一部分置入4%的甲醛中固定48 h，一部分行碱性磷酸活性及钙含量测定，行碱性磷酸活性及钙含量测定时随机取一块大小相同的大腿部正常肌肉组织作为空白对照组。剩余树鼩继续按同等条件饲养。

1.2.4 组织学观察

不同时期处死的标本固定完成并修整标本块后通过脱钙、 流水冲洗、 脱水透明、 浸蜡包埋。然后以植入材料区域为中心做矢状面组织切片， 切片厚 5 μm，分别行HE染色和Masson三色染色，二甲苯透明中性树胶封固，光镜下观察。

1.2.5 碱性磷酸酶活性测定

取约0.2 g标本组织称重后，加入l mL去离子水研磨成匀浆，吸入离心管中，用l mL去离子水洗匀浆2次，均吸入同离心管，4℃下离心30 min (12 000 r/min)，加细胞裂解液破膜。按ALP试剂盒进行检测，于520 nm波长处测定吸光度，并按其提供公式计算各管中计算单位质量标本组织ALP活性(kat/g)。

1.2.6 钙含量测定

将植入物周围组织的去上清离心沉淀物用盐酸消化，用原子吸收分光光度仪测定钙含量，以标本湿重(mg)为除数，得出单位重量标本含钙量(μg/mg湿重组织)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大体观察结果

所有实验动物术后同一条件下分笼饲养， 其活动、 进食、 精神状态良好，背部创口均为一期愈合，无明显感染、无材料脱落现象。术后 1～5 d，背部术区创面黏膜略充血发红，术后 10 d所有动物背部术区创面愈合，可拆线。

2.2 组织学结果

2.2.1 大体观察

术后4周，可见植入材料分散在肌肉内，材料硬度高,骨修复材料颗粒棱角分明，骨材料表面部分肌肉附着；术后8周，植入骨材料在肌肉内呈分散状态，骨修复材料颗粒棱角较4周时明显变圆钝，骨修复材料已被肌肉完全包裹；术后12周，可见植入材料在肌肉内更加分散，骨修复材料表面圆钝，表面完全被肌肉附着，材料较大的空隙内可见有软组织生长。

2.2.2 HE染色的组织学改变

(1)术后4周：各组植入材料均较硬,且材料颗粒与颗粒之间呈分散状，无法行常规组织切片。

(2)术后8周：由图1可见：实验组植入材料局部可见钙化灶(约5%)，植入材料周边可见纤维组织增生(5%～10%)，实验组较多异物巨细胞，明显聚集，无其他炎症细胞，表明多孔HAPw/n-ZnO复合材料引起了机体炎症反应；ATLANTIK人工骨组植入材料局部可见钙化灶(约5%)，植入材料周边可见纤维组织增生(5%～10%)；Bio-Oss组：植入材料局部和肌间质内可见钙化灶(5%～10%)，植入材料周边可见纤维组织增生；金世植骨灵组植入材料局部和肌间质内可见钙化灶(5%～10%)，植入材料周边可见纤维组织增生。

(3)术后12周：图2可见：实验组植入材料局部可见钙化灶(5%～10%)，植入材料周边可见较多纤维组织增生(10%～15%)，实验组较多异物巨细胞，明显聚集； ATLANTIK人工骨组植入材料局部可见钙化灶(5%～10%)，植入材料周边可见纤维组织增生(5%～10%)；Bio-Oss组：植入材料局部和肌间质内可见钙化灶(约10%)，植入材料周边可见纤维组织增生；金世植骨灵组植入材料局部和肌间质内可见钙化灶(约10%)，植入材料周边可见纤维组织增生。

2.2.3 Masson三色染色观察胶原纤维分布

(1)术后4周：植入材料过硬，无法行常规组织切片。

(2)术后8周：由图3可见，实验组植入材料周边少量绿染的骨胶原纤维，肌肉间质内未发现骨胶原纤维； ATLANTIK人工骨组：植入材料周边出现少量绿染的骨胶原纤维，肌肉间质内未发现骨胶原纤维，但颜色较实验组深；Bio-Oss组：植入材料周边和肌肉间质内均发现少量绿染的骨胶原纤维，颜色较实验组深；金世植骨灵组：结果与Bio-Oss组基本一致。

Masson三色染色结果绿染的骨胶原纤维说明有少量不成熟的骨组织，Bio-Oss组与金世植骨灵组绿染的范围与深度均优于实验组。ATLANTIK人工骨组则略优于实验组。

图1 术后8周植入材料周围的肌肉组织的病理改变(HE染色,×400)Figure 1 Histology of the muscle tissues around implant material at 8 weeks after surgery(HE staining，×400)

图2 术后12周植入材料周围肌肉组织的组织学改变(HE染色，×400)Figure 2 Histological changes in the muscle tissues aound the implant material at 12 weeks after surgery(HE staining，×400)

图3 术后8周肌肉组织中的骨胶原分布(Masson三色染色，×400)Figure 3 Distribution of collagen fibers in the bone tissues at 8 weeks after surgery(Masson trichrome staining，×400)

(3)术后12周：由图4可见：各组植入材料周边出现绿染的范围较8周时并无明显变化，但色泽较8周时略深，各组均没有出现蓝染和红染。

实验组和ATLANTIK人工骨组依然只有植入材料周边出现少量绿染的骨胶原纤维，肌肉间质内未发现骨胶原纤维； Bio-Oss组与金世植骨灵组：植入材料周边和肌肉间质内均发现少量绿染的骨胶原纤维，颜色较实验组和8周时变深。

Masson三色染色有绿、蓝、红三色，由绿至红说明骨质变得更为成熟。Bio-Oss组与金世植骨灵组绿染的范围与深度均优于实验组，ATLANTIK人工骨组则略优于实验组，但均未在8周时在树鼩背部肌肉内诱导出较为成熟的骨组织，但均体现出较强的体内生物活性。

2.3 碱性磷酸酶活性检测结果

在三个不同的时间段，实验组较Bio-Oss组、金世植骨灵组和正常肌肉组差异有统计学意义(P< 0.05)，Bio-Oss组与金世植骨灵组优于实验组，实验组优于正常肌肉组，且差异有统计学意义。与ATLANTIK人工骨组差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

图4 术后12周肌肉组织内的胶原纤维分布(Masson三色染色，×400)Figure 4 Distribution of collagen fibers in the bone tissues at 12 weeks after surgery(Masson trichrome staining，×400)

组别Groups4周4 weeks8周8 weeks12周12 weeksATLANTIK人工骨ATLANTIK artificial bone0.60 ± 0.150.72 ± 0.250.85 ± 0.30实验组Experimental group0.58 ± 0.700.68 ± 0.300.80 ± 0.31Bio-Oss Bio-Oss1.10 ± 0.181.30 ± 0.301.50 ± 0.36金世植骨灵Jinshi Zhiguling artificial bone1.15 ± 0.211.52 ± 0.351.68 ± 0.42正常肌肉Normal muscle0.18 ± 0.040.18 ± 0.040.18 ± 0.04

表2 各组肌肉组织中钙含量在不同时间点的变化Table 2 Calcium content in the muscle tissues in each group at different time points s, μg/mg)

2.4 钙含量检测结果

在三个不同的时间段，实验组较Bio-Oss组、金世植骨灵组和正常肌肉组差异有统计学意义(P< 0.05)，Bio-Oss组与金世植骨灵组优于实验组，实验组优于正常肌肉组，且差异有统计学意义，与ATLANTIK人工骨组差异无统计学意义(P> 0.05)。钙含量检测结果见表2。

3 讨论

选择合适的动物作为骨修复材料肌肉植入是研究的前提及基础[4-5]。很多研究报道钙磷陶瓷植入狒狒、犬、羊、猪、兔、鼠的非骨性部位(如肌肉和皮下)有骨诱导出现[6-7]，不同的结果可能是因为动物种属间的差异和植入物差异造成。但以树鼩作为人工骨材料肌肉植入实验的实验动物还未见报道。

在本实验中的四种人工骨，除本课题组自制的多孔复合材料HAPw/n-ZnO外其余三种均已用于临床，ATLANTIK人工骨主要成分为70%的羟基磷灰石与30%的磷酸三钙；Bio-Oss为脱钙牛骨；金世植骨灵为经过特殊处理并复合BMP的牛骨。将四种人工骨材料植入树鼩背部肌肉中，最长为12周。通过组织学观察，均未发现成熟的新生骨组织出现，但出现一些钙化灶和幼稚的骨胶原纤维即本研究制备的多孔HAPw/n-ZnO复合材料与植入树鼩背部肌肉12周后并未诱导出成熟的骨质，尚不能说明多孔复合材料HAPw/n-ZnO是否具有异位成骨能力，但体现出一定的成骨活性。种植体植入部位，也同样影响种植体内骨形成。为了顺利诱导出骨细胞产生，脱钙骨基质通常种植部位是在小鼠的后肢股部肌肉陷窝内，大鼠及兔子的腹部肌肉内及狗颈背部肌肉内。因而，种植体植入部位选择不当可能无法诱导骨形成[8-9]。树鼩作为人工骨材料软组织植入实验动物目前在国内外还未见报道，树鼩在生理解剖、神经发育、肝炎病毒感染特性及心理应激模式等方面与灵长类，甚至与人类高度相似[10-11]，且树鼩具有较强的抗感染能力，其大腿部肌肉和背部肌肉可作为口腔科填充类骨材料肌肉植入模型的选择，但因为树鼩个体较小，肌肉较薄，如果是块状骨材料植入时不易操作。本研究结果显示，树鼩可成功构建骨材料肌肉植入动物模型。与非人灵长类动物相比，树鼩来源广泛、价格低廉，可预测树鼩在口腔骨材料相关研究中具有良好的应用前景。

本研究通过ALP及钙含量活性检测发现Bio-Oss组与金世植骨灵组优于实验组，实验组优于正常肌肉组，与ATLANTIK人工骨组差异无统计学意义。ALP是成骨细胞和成骨细胞分化的代表性酶，ALP作为成骨细胞表型特征之一，在体内外钙化中起关键性作用，随着ALP升高的同时出现大量钙盐的沉积，ALP活性越高，表明成骨前体细胞向成骨细胞分化越明显[12-13]。本实验中组织学发现实验组与ATLANTIK人工骨组植入材料表面有钙化灶，Bio-Oss组与金氏植骨灵组在植入材料表面与肌肉间质内均发现有钙化灶，表明植入材料表现出生物活性，为骨组织形成提供了部分条件。

本实验不足之处：首先树鼩用量较少，其次观察时间较短，不能更好的了解骨材料的异位成骨能力。

本实验中，实验组中机体出现了炎症反应且长时间存在，该结果与国内外的一些研究符合。国外研究认为，n-ZnO导致细胞产生过量的活性氧，使细胞内氧化和抗氧化状态失去平衡，发生氧化应激反应，导致细胞氧化损伤。如何在发挥n-ZnO优异的抗菌性能的同时避免其引发的氧化应激反应[14-17]，本课题组将进一步研究。

4 结论

多孔复合材料HAPw/n-ZnO植入到树鼩背部肌肉中12周后未异位成骨，对照组骨修复材料也未异位成骨，但均体现出异位成骨潜力；多孔复合材料HAPw/n-ZnO植入机体后引起炎症反应。