雷先会，赵蔚萍，杨 森

热休克蛋白60（HSP60）为细菌的主要抗原，其作用机制尚不明确。可能是通过介导细菌附着于上皮细胞，刺激宿主免疫反应[1]，进而诱导感染。研究表明，由耶尔森氏菌和幽门螺杆菌纯化而来的HSP60可诱导人胃黏膜上皮细胞分泌IL-8，但大肠杆菌纯化得到的HSP60却不能[2]。因此，HSP60的作用机制似乎与其细菌来源密不可分。放线共生放线杆菌（Aa）是重要牙周致病菌，可扰乱宿主免疫防御系统[3]。国外研究报道，Aa可侵入人口腔颊黏膜上皮细胞[4]。邹博等[5]采用荧光原位杂交技术和激光共聚焦扫描显微镜检测到，在颊黏膜上皮细胞内，Aa占全细菌的相对比例为60%～100%，提示Aa可在口腔黏膜上皮内定植，是口腔黏膜病的主要致病菌。本研究从Aa中提取并纯化HSP60的细菌同源物GroEL（AaGroEL），研究其对OMECs增殖的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 AaGroEL的纯化 采用ATP-琼脂糖亲和层析及SDS-PAGE凝胶电泳，从Aa（ATCC公司）中提取并纯化AaGroEL[6]。

1.2 OMECs分离培养及干预 收集15名正常牙周健康者的口腔黏膜，其中男性7名，女性8名。口腔黏膜经PBS反复洗涤后，去除黏膜下组织，浸入2.5 g/L的中性蛋白酶中，4℃消化18 h。然后撕下上皮层，置入 0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA（1∶1）的混合消化液中，37℃振荡消化10 min；再加入10%胎牛血清终止消化，用吸管吹打制备成单细胞悬液，接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37℃恒温箱培养。当OMECs细胞汇合度达到80%以上时，转入无血清的DMEM培养基中培养24 h。 然后加入 0.25 g/ml的 AaGroEL（HSP60组），对照组则加入溶媒。

1.3 细胞增殖率检测 将上述两组细胞以1×103的密度接种于96孔板，5%CO2、37℃恒温箱培养。分别于培养 0、6、12、24、48、72、96、144 h 时， 加入10 μl的 CellTiter 96®Aqueous溶液（美国Promega公司），37℃避光孵育4 h，采用酶标仪在490 nm处检测吸光度，计算细胞增殖抑制率。每次做4个平行试验，重复3次。细胞增殖抑制率=（1－HSP60组吸光度/对照组吸光度）×100%。

1.4 实时定量PCR检测 取与AaGroEL孵育12 h和96 h的OMECs，采用实时定量PCR法，检测细胞内信号调节激酶（ER K）、丝裂原激活蛋白激酶p38（p38）、蛋白磷酸酶 1（PP1）基因的表达水平。

此外，将OMECs随机分为对照组、Heat组和Heat+HSP60组。分别以1×103个细胞/孔接种于96孔板，培养24 h后，将Heat组和Heat+HSP60组置于45℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的细胞培养箱中孵育30 min；对照组置于37℃的细胞培养箱中孵育30 min。之后再向Heat+HSP60组中加入0.25 μg/ml的AaGroEL，对照组和Heat组加入溶媒，于37℃孵育12 h。采用实时定量PCR检测3组细胞中HSP60和HSP70的表达。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析，数据以±s表示，多组间比较采用One-way ANOVA，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AaGroEL对OMECs增殖的影响 与对照组比较，在孵育12 h前，AaGroEL促进OMECs的增殖；而在孵育12 h后，AaGroEL对OMECs的增殖有显著的抑制作用。见图1。

图1 AaGroEL对口腔上皮细胞增殖的影响

2.2 AaGroEL对MAPKs相关分子基因的影响与对照组比较，孵育12 h时，AaGroEL显著增加ER K1和ER K2的表达，均抑制p38和PP1的表达（P<0.05）；孵育 96 h 时，AaGroEL 显著降低 ER K1和ER K2的表达，均增加p38和PP1的表达（P<0.05）。 见表 1。

表1 MAPK信号通路中各信号分子mRNA的相对表达

2.3 AaGroEL抑制细胞内HSP60的表达 与对照组比较，Heat组HSP60和HSP70的表达均显著增加（P<0.05）；而Heat+HSP60组HSP60与对照组无显著差异，HSP70与Heat组比较无显著差异（P>0.05）。 见表 2。

表2 AaGroEL对细胞内HSP60表达的影响

3 讨论

热休克蛋白(HSPs)是一类高度保守的应激蛋白，作为“分子伴侣”保护蛋白免于高温损伤。HSP60是一种线粒体伴侣蛋白，通常负责蛋白质从细胞质向线粒体基质的转运和重折叠[7]。HSP60细菌同源物GroEL已得到广泛研究，将HSP60与糖尿病、应激反应、癌症和某些免疫疾病联系起来[7]。

研究表明，用从Aa中纯化AaGroEL刺激上皮细胞48 h，可显著促进其增殖[8]。但本研究发现，在孵育12 h前，AaGroEL促进OMECs的增殖；而在孵育12 h后，AaGroEL对OMECs的增殖有显著的抑制作用。提示AaGroEL短期孵育可促进OMECs的增殖，但只要达到一定的孵育时间后，却转而抑制OMECs的增殖。因此推断，长期细菌感染可抑制OMECs的增殖，此为口腔溃疡形成的可能机制。

为探究HSP60对OMECs增殖长期和短期影响不同的原因，本课题检测AaGroEL孵育12 h和96 h后MAPKs相关分子ERK以及细胞死亡标志物p38表达的变化。结果表明，AaGroEL短期孵育可促进ERK1/2的表达，而长期孵育可促进p38的表达。由于ERK1/2与细胞增殖和存活有关，而p38激活诱导细胞死亡。提示AaGroEL短期孵育可促进OMECs的增殖，长期孵育则诱导细胞死亡，AaGroEL短期孵育诱导OMECs增殖的原因可能与激活ERK1/2有关。PP1表达的变化进一步证实了这一点，因为MAPKs的激活受蛋白磷酸酶（PP）的调控，PP激活可使MAPKs去磷酸化而丧失活性。PP1为丝/苏氨酸磷酸酶和多种激酶（包括蛋白激酶 Cα、Akt、Bcl2、Src和 ERK）的抑制剂[9]。因此，AaGroEL短期孵育时PP1的表达降低，ERK1/2激活，促进OMECs增殖。AaGroEL长期孵育抑制OMECs增殖的原因可能与p38表达的增加有关，而且此时PP1的表达也增加，ERK1/2去磷酸化，MAPKs受阻，OMECs增殖抑制。

细胞内HSP60在细胞应激损伤时起保护作用。Ranford等[10]的研究显示，当细胞暴露于HSP60的细菌同源物（GroEL）时，可诱导宿主细胞产生大量抗体，而这些抗体可与人HSP60蛋白交叉反应。也就是说，AaGroEL可刺激免疫系统产生HSP60抗体，即便细菌和人类HSP60具有不同的蛋白质序列，但这些抗体依旧可以识别并攻击人胞内HSP60，降低HSP60诱导口腔黏膜病病灶恶化的生物学作用。本研究也发现，AaGroEL孵育12 h可显著抑制热刺激诱导的胞内HSP60表达的增加，但对热刺激诱导的HSP70表达无显著影响，证实与AaGroEL短期孵育，可导致细胞内产生大量的HSP60抗体。

总之，AaGroEL短期处理促进OMECs增殖，而长期处理则抑制OMECs增殖，其机制可能与AaGroEL双调控MAPK信号通路有关。