阮灏，胡桃红，马晓娟，苗洋，李丹丹，殷惠军

近年来，很多学者从血栓形成的病理生理角度及中药药理的作用机制方面揭示了益气活血法可以改善血液流变学、调节循环、抑制炎性反应、调整免疫功能及机体反应性等[1]。本研究借助颈动脉血栓大鼠模型，应用丹参和西洋参配伍组成益气活血复方，评价其抗血栓形成作用及其作用机制，以期为课题组后续的实验奠定基础、为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组健康SD大鼠50只，雄性，体重（180±20）g，由北京斯贝福实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0002。动物于实验室动物房饲养，饮水、饲料充足。室温（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，实验室定期消毒。将大鼠随机分为5组，分别为假手术组（S）、模型组（M）、阿司匹林组（A）、益气活血复方高剂量组（H）、益气活血复方低剂量组（L）。益气活血复方高、低剂量组将供试物分散于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）中，以生药量计，高剂量组丹参6 g/kg、西洋参2 g/kg，低剂量组丹参1.5 g/kg、西洋参0.5 g/kg；阿司匹林组将阿司匹林原料药分散于0.5%CMC中，给药剂量为100mg/kg；假手术组和模型组分别给予0.5%CMC。适应性喂养5 d，预防性给药7 d后手术，之后连续干预3周。每周称重1次以调整给药剂量。

1.2 药物及试剂西洋参（吉林易天健药业，批号：4258876）、丹参（同仁堂，产地：山东，批号：601002133）、大孔树脂（D-101，天津兴南允能高分子技术有限公司）、乙醇（色谱纯，Fisher）。以丹参中丹参酮ⅡA、丹酚酸B作为考察指标，使用乙醇回流提取，药渣挥干乙醇，再次用水提取，分别得到丹参中脂溶性成分与水溶性成分。以西洋参中人参皂苷Rg1、Rb1、Re总量作为考察指标，使用乙醇回流提取，得到西洋参脂溶性成分。采用大孔树脂分离手段，分别进行有效物质的纯化，分别得到丹参和西洋参有效部位，将所得有效部位按生药量3：1混合均匀，制成益气活血复方。阿司匹林原料药（50782，武汉欣欣佳丽生物科技有限公司）；羧甲基纤维素钠（151204，安徽山河药用辅料有限公司）；戊巴比妥钠（57330，北京化学试剂公司）；血栓素B2（TXB2）ELISA Kit（E02T0025，上海蓝基生物科技有限公司）；6-酮-前列腺素1α（6-K-PGF1α）ELISA Kit（E02A0685，上海蓝基生物科技有限公司）；抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）ELISA Kit（E02A0895，上海蓝基生物科技有限公司）；蛋白C（PC）ELISA Kit（E02O0722，上海蓝基生物科技有限公司）；纤溶酶原（PLG）ELISA Kit（E02P0127，上海蓝基生物科技有限公司）；内皮素-1（ET-1）ELISA Kit（E02E0040，上海蓝基生物科技有限公司）。

1.3 仪器台式高速冷冻离心机（Sorvall ST 8R，Thermo Fisher）；低速自动平衡离心机（LDZ5-2，北京京立离心机有限公司）；电子天平（ALC-210.3，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；小动物麻醉机（tabletop，北京友诚嘉业生物科技有限公司）；超声波清洗机（SB-120DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；电子体重秤（ACS，中山市衡新电子有限公司）；大鼠恒温实验台（JR-30，成都泰盟软件有限公司）；移液枪（100～1000 μl，20～200μl，eppendorf）；手术器械（F套装，上海玉研手术器械有限公司）。

1.4 颈动脉血栓模型制备大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（2 ml/kg）麻醉，后仰卧位固定，颈部备皮后，皮肤表面先用碘伏涂擦手术野皮肤，用灭菌器材沿颈中线纵行切开颈部皮肤约3 cm，剪开浅筋膜，止血钳钝性分离胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌之间的肌间隙，暴露气管，用玻璃分针分离出右侧颈总动脉约3 cm，可在颈动脉滴少量盐酸利多卡因，防止刺激迷走神经。将自制塑料垫（5 cm×1 cm）置于已分离出颈动脉下方，用来分隔血管与周围组织，防止周围组织被腐蚀；移液枪吸20 μl的50% FeCl3溶液倒入事先准备好的滤纸片（1 cm×1 cm）上，并环敷在右侧颈总动脉，用镊子轻夹接口处使滤纸环贴紧动脉壁30 min后取下，用生理盐水冲洗局部组织。假手术组颈总动脉分离方法同上，暴露颈总动脉后，将吸有20 μl生理盐水的小片滤纸（1 cm×1 cm）环敷在此段动脉上，30 min后取下，用生理盐水冲洗局部组织。手术结束后将每只大鼠伤口处滴少量青霉素防止感染，并肌注少量青霉素，逐层缝合，回笼饲养。

1.5 E-Lisa法检测大鼠血浆指标大鼠禁食不禁水至少8 h，取血前1.5 h完成末次灌胃给药后采集血浆样本，采集后先室温静置0.5 h，离心机离心15 min（3000 rpm），取上清，-20℃分装保存备用。取出试剂盒，先室温放置30 min。取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100 μl的标准品溶液于空白微孔中。空白微孔中加入100 μl的样品，空白对照加入100 μl的磷酸盐缓冲液（PH 7.0～7.2）。除空白对照外，在其它组各孔中加入50 μl的酶标记溶液。将酶标板用封口胶密封后，保持37℃恒定温度孵育反应1 h。过后将酶标板反复清洗5次，保持各孔有充足的水压。酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。各孔加入显色剂A 50 μl。各孔加入显色剂B 50 μl。避光反应10 min后各孔加入50 μl终止液，终止反应。

1.6 统计学方法所有实验数据均采用SPSS 19.0统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。多个样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用最小显著差异t检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血栓模型构建情况应用FeCl3外敷颈总动脉诱导血栓形成法构建大鼠颈动脉血栓模型，通过肉眼观察M组有明显血栓形成（图1）。

2.2 各组间血浆指标含量比较与S组比较，M组TXB2含量、TXB2/6-K-PGF1α比值、ET-1含量升高（P＜0.05）；6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量降低（P＜0.05），差异有统计学意义。与M组比较，H组、L组6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量升高（P＜0.05），TXB2含量、TXB2/6-K-PGF1α比值显著降低（P＜0.01）；A组TXB2、PLG含量、TXB2/6-K-PGF1α比值显著降低（P＜0.01），6-K-PGF1α含量显著升高（P＜0.01），差异有统计学意义（表1）。

2.3 各组ET-1含量比较与M组比较，H、L组ET-1含量虽有降低趋势，但无统计学差异（P＞0.05，表2）。

3 讨论

以血栓形成为病理基础的心脑血管疾病已成为威胁人类健康的头号“杀手”。血液充盈、心气充沛和脉道通利等任何一个环节的异常都会致使血行不畅，导致血栓形成[2]。阿司匹林作为抑制血小板聚集的药物，是防治血栓的代表。流行病学调查结果显示，5%～45%服用阿司匹林的患者未能从抗血小板治疗中获得理想效果，出血倾向及长期服药导致的肝损害也是阿司匹林表现出的一定副作用[3,4]。

图1 大鼠经FeCl3环贴造模前后对比图

表1 各组TXB2、6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量、TXB2/6-K-PGF1α比值比较（±s）

表1 各组TXB2、6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量、TXB2/6-K-PGF1α比值比较（±s）

注：TXB2：血栓素B2；6-K-PGF1α：6-酮-前列腺素1α；PC：蛋白C；AT-Ⅲ：抗凝血酶Ⅲ；PLG：纤溶酶原；与假手术组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别 TXB2（pg/ml） 6-K-PGF1α（pg/ml） TXB2/6-K-PGF1α PC（ng/ml） AT-Ⅲ（μg/ml） PLG（ng/ml）S 247.20±39.67 32.29±5.91 7.91±2.10 2.96±0.27 20.59±3.18 98.99±13.21 M 299.33±31.37b 26.47±4.85a 11.54±2.55b 2.49±0.57a 17.79±1.66a 80.05±20.36a A 132.25±43.85d 35.96±9.97c 3.73±0.76d 2.09±0.58 19.54±2.66 72.62±36.67 L 259.34±38.38c 33.91±8.68c 5.63±1.33d 3.02±0.52c 21.69±4.37c 164.15±44.92d H 230.45±49.72d 39.67±12.65d 4.14±1.13d 3.39±0.84c 21.53±3.48d 153.35±37.66d

随着对中药药理学不断深入地研究，证实了多种中药、中药有效成分及组方可以发挥较好的抗血栓作用[5]。中药抗血栓的作用虽平和，具有作用靶点、通路多，不良反应较小，安全性高，价格低廉等优点，中药为防治血栓提供了一条新的思路[6]。本实验所使用的益气活血复方由丹参、西洋参有效部位组合而成。丹参活血化瘀、通经止痛、凉血消痈[7]；西洋参补气养阴、清热生津[8]。两药有效部位按比例组合，补气而不壅中，活血而不伤正。

近几年，通过对血栓形成的研究，发现血管内皮细胞功能障碍或损伤为血栓形成的始动因素，其中血小板的活化发挥重要作用。此外凝血系统、纤溶系统的异常也参与了其病理过程[9]。

血栓素A2（TXA2）、前列腺素I2（PGI2）都是花生四烯酸（AA）的重要代谢产物。细胞中的AA正常情况下不会以游离的形式存在，但当遇到组织损伤或者刺激因子时可游离出来，在环氧化酶作用下转变为不稳定的中间代谢产物前列腺素（PG）。血小板中的TXA2合成酶将过氧化物合成为TXA2，EC上的PG合成酶将过氧化物合成为PGI2。TXA2是目前发现的最强的血小板聚集剂和缩血管物质之一，但性质不稳定，很快会转化为稳定、无生物活性的TXB2[10]；PGI2是通过抑制血小板功能和扩张血管来发挥抗血栓作用的生物活性物质，也极不稳定，会迅速转变为稳定的但无生物活性的6-K-PGF1α[11]。TXA2和PGI2互为拮抗，生理状态下的活性平衡可以保持血管正常的收缩与舒张功能，二者之间一旦平衡失调，则容易导致血栓形成[12]。本实验结果表明，与S组相比，M组血浆中TXB2含量升高，6-K-PGF1α含量降低（P＜0.01），可能是因为FeCl3化学腐蚀法造成模型血管内皮损伤，导致AA游离，增加TXA2生成；合成PGI2减少，减弱了拮抗TXA2的能力，加速血小板的活化，导致生成血栓。与M组相比，A组对TXB2抑制最为突出，对6-K-PGF1α含量并无影响，推测阿司匹林是通过抑制TXA2的合成来防治血栓生成的。H组、L组与M组相比，均能降低血浆TXB2含量，升高6-K-PGF1α含量，并且能够降低TXB2与6-K-PGF1α比值，原因可能是复方通过改变花生四烯酸代谢途径，保持TXB2与6-K-PGF1α比值平衡；通过减少TXA2合成抑制血小板功能亢进，并且促进内皮细胞（EC）功能恢复，分泌PGI2舒张血管、抑制血小板聚集，发挥抗血栓形成的作用。为此我们推断，改变AA代谢途径可能是益气活血复方抗血栓的作用机制之一。

表2 各组ET-1含量比较（±s）

表2 各组ET-1含量比较（±s）

注：ET-1：内皮素-1；与假手术组比较，aP＜0.05

组别 E T-1（n g/m l）S 0.3 3±0.0 6 M 0.4 5±0.1 7 a A 0.3 7±0.1 4 L 0.4 1±0.1 5 H 0.4 4±0.1 5

在凝血系统中，抗凝血酶（AT）和蛋白系统都扮演重要角色，无论何因引起它们的结构变化或是缺乏减少都可以使得血液抗凝活性降低，导致血栓生成。血浆抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）是体内主要的抗凝物质，由肝细胞产生，反映机体抗凝系统功能，对灭活凝血酶有持久作用，还可灭活其它凝血因子[13-15]。本实验结果表明，与S组相比，M组中血浆AT-Ⅲ含量降低，可能是因FeCl3化学腐独法造成血管EC损伤，从而使EC表面AT-Ⅲ减少，同时使内、外源性凝血途径激活，产生凝血酶消耗AT-Ⅲ使之含量下降。与M组相比，H组、L组均能够不同程度的升高AT-Ⅲ含量，可能是由于益气活血复方可以促进机体分泌一些类肝素物质，使得AT-Ⅲ的抗凝活性作用增加，从而灭活凝血酶和凝血-抗凝血酶复合物，抑制血栓的形成。为此我们考虑，增强抗凝系统活性也是益气活血复方抗血栓的作用机制之一。A组与M组比较，未体现统计学差异，可能其在此通路不发挥作用或作用不显著。

蛋白系统中的最主要组成部分是蛋白C（PC），PC本身是酶原，激活后的PC（APC）抗血栓的作用很强，主要体现在PC可以灭活凝血辅因子，APC能使凝血因子FVa和FVⅢa发生酶解，发挥灭活作用；对FVa具有酶解灭活作用，阻碍其与血小板结合，从而降低FVa对凝血酶原激活的作用；APC还可刺激纤溶酶促使纤溶蛋白溶解，借助纤维蛋白降解产物以增强自身的抗凝作用[16]。本实验结果表明，与S组相比，M组PC含量下降，可能是由于形成血栓过程中，血管EC受损、大量凝血酶活化导致PC合成的抗凝因子减少、产生消耗。与M组相比，H组、L组均可使PC含量升高，分析原因，益气活血复方可能在激活AT-Ⅲ途径后致使凝血因子失活，对PC的消耗减少、含量升高，进而使APC浓度升高、活性增强，发挥抑制血栓形成的作用。与M组比较，A组血浆PC含量未体现统计学差异，可能其在此通路不发挥作用或作用不显著。

正常人体的纤溶系统在防止出血、保持管道通畅、阻止血栓生成发挥重要的作用。纤溶系统最核心的成分是纤溶酶原（PLG）[17]。在活化剂的作用下，PLG转化为纤溶酶（PL）是纤溶过程中极为重要的一步。但PL性质不稳定，少量在血循环中出现的PL会被a2-抗纤溶酶迅速灭活，因此不易直接检测，可通过测定PLG的含量来间接得知PL的活性水平[18,19]。本实验的结果表明，与S组相比，M组PLG含量下降，可能是因血栓形成过程中，血液中PLG与局部纤维蛋白结合，致使游离的PLG含量减少。与M组相比，H组、L组PLG含量显著升高，由此我们推断，PLG含量的升高使得t-PA活性增强，从而增强了纤溶功能，可以抑制凝血过程甚至溶解已经形成的栓子，发挥抗血栓的作用。与S组相比，M组的血浆PLG含量与模型组比较未体现统计学差异，可能其在此通路不发挥作用或作用不显著。

内皮素（ET）是一种具有血管活性的多肽，于1988年由 Yanagisawa等从猪的主动脉内皮细胞培养液中提取[20,21]，在机体各组织、细胞中分布广泛，是一种极强的缩血管物质，可维持心血管系统稳态和基础血管张力。ET-1增多见于血栓前状态、各类心绞痛等，ET-1含量较高，形成血栓的可能性要高于ET-1含量正常的群体。本实验结果表明，与M组相比，H组、L组对血浆ET-1含量的影响虽有降低趋势，但并无统计学差异，原因很可能是益气活血复方在此通路作用不显著。

本研究结果研究发现，在体外实验中，益气活血复方可从抑制血小板活化、改善凝血状态及激活纤溶系统等不同作用环节抑制血栓形成。本课题组在总结益气活血复方能有效改善血栓形成作用机制的同时，仍需进一步进行更深入的相关作用通路及靶点研究，以期为日后的临床应用提供更为有价值的实验证据。丹参和西洋参的联合应用也成为临床遣药组方治疗疾病的方向之一。