李玉辉 陆丽娟 王磊 张晓茹 胡万宁 李玉凤

神经胶质瘤起源于神经胶质细胞，是常见的颅内原发肿瘤。2016 年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在2007 版基础上对胶质瘤的分类与分级进行了修订和完善。根据恶性程度将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级4 个病理等级，病理等级越高，胶质瘤的恶性程度越高[1]。分子亚型的引入能更客观地以生物学同质性精准定义肿瘤类型[1]。胶质瘤是由先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所致。表观遗传调控是遗传与环境相互作用的重要纽带，在恶性肿瘤发生发展中的作用日益受到重视[2]。阐明胶质瘤发生发展的表观遗传机制有利于全面地认知胶质瘤。

泛素样含PHD 和环指域蛋白1（ubiquitin-like con-taining PHD ring finger 1，UHRF1）是一个重要的表观遗传调控因子，参与调控DNA 甲基化修饰，是近些年肿瘤领域研究的热点[3]。正常细胞中UHRF1表达具有周期差异性特点，在静止的细胞内不表达或者低表达，但在增殖的细胞内呈高表达，促进G1期向S 期转换[4]。而UHRF1 在肿瘤细胞的任何细胞周期中均为高表达，是导致肿瘤细胞持续增殖以及基因组DNA 甲基化异常的重要因素之一[3]。

蛋白质的动态平衡是蛋白发挥正常生物学功能的重要条件，泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的重要调节机制。β-转导重复相容蛋白1（βtransducin repeat-containing protein 1，β-TrCP1）是一种E3 泛素连接酶，介导多种底物蛋白泛素化，继而被蛋白酶体所降解[5]。疱疹病毒相关性泛素特异性蛋白酶（herpes associated ubiquitin specific proteas，HAUSP）是泛素酶家族成员之一，能水解底物蛋白与泛素化链之间的链接，抑制蛋白降解，从而增加蛋白的稳定性[6]。β-TrCP1 和HAUSP 在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视[5-6]。不同级别胶质瘤中β-TrCP1、UHRF1 及HAUSP 三种蛋白表达的相关性及与临床病理特征的相关性尚不明确。本研究旨在通过免疫组织化学的方法分析DNA 甲基化调控因子UHRF1 及泛素化酶β-TrCP1 和去泛素化酶HAUSP 在不同分级的胶质瘤组织中的表达差异，以及β-TrCP1、UHRF1 和HAUSP 与胶质瘤临床病理特征的相关性，以期为阐明胶质瘤的发生发展机制提供表观遗传基础依据。

资料与方法

一、研究对象

选取唐山市人民医院病理科自2011 年6 月至2015 年5 月经外科手术切除、石蜡包埋的胶质瘤组织84 例，所取组织的胶质瘤患者病例资料完整。全部蜡块标本均由2 名病理科医生通过镜下检测确认其病理诊断。本研究程序经唐山市人民医院伦理委员会审核通过，标本采集均与患者家属签署知情同意书。

二、主要试剂

β-TrCP1 抗体（RD 公司，美国），UHRF1 抗体（SAB 公司，美国），HAUSP 抗体（SANTA 公司，美国），免疫组织化学染色试剂盒（北京博奥森生物技术公司），3,3-二氨基联苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）显色剂（北京中杉生物技术有限公司）。

三、免疫组织化学染色

所有病理切片均采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法染色，石蜡切片置于56℃烤箱烤片50 min，二甲苯脱蜡，3%H2O2溶液阻断灭活内源性过氧化物，枸橼酸缓冲液高压修复，5%牛血清白蛋白溶液封闭，一抗4℃过夜（β-TrCP1抗体1∶33 稀释；UHRF1 抗体1∶200 稀释；HAUSP 抗体1∶100 稀释；PBS 代替一抗作为阴性对照），室温复温30 min，二抗采用二步法免疫组织化学染色试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，DAB 显色，苏木精复染，常规脱水，树脂封片。

免疫组织化学分析结果评估采用染色比例评分（proportion score，PS）和染色强度评分（intensity score，IS）二级计分法[7]。PS 基于阳性染色范围的比例：无显色为0 分；＜1%为1 分；1%～10%为2 分；10%～33.3%为3 分；33.3%～66.7%为4 分；＞66.7%为5 分。IS 基于阳性的平均染色强度：无显色为0 分；淡黄色为1 分；黄或者深黄色为2 分；褐或者深褐色为3分。采用Allred 评分系统（Allred score=PS+IS）作为免疫组织化学的半定量评判标准，总分8 分，1～8 分的定义为阳性（+），0 分的定义为阴性（-）[7]。

四、统计学分析

采用SPSS17.0 软件进行数据统计分析。3 种蛋白阳性率和阴性率用率（%）表示，行χ2检验。采用Spearman 等级相关分析法分析胶质瘤组织中2 种蛋白的相关性。显著性检验水准取双侧α=0.05，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结果

一、β-TrCP1、UHRF1 和HAUSP 蛋白在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中表达情况

84 例Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织的免疫组织化学染色结果显示，表观遗传因子UHRF1、泛素化酶β-TrCP1和去泛素化酶HAUSP 在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中均表达，3 种蛋白均主要定位于细胞核（图1）。

图1 β-TrCP1、UHRF1 和HAUSP 蛋白在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中的免疫组织化学染色结果（×600）

二、UHRF1、β-TrCP1 和HAUSP 蛋白表达与胶质瘤临床病理特征的相关性分析

UHRF1、β-TrCP1 和HAUSP 蛋白阳性率均与胶质瘤患者的年龄、性别无关（P＞0.05）。3 种蛋白阳性率均与胶质瘤患者的WHO 病理分级有关，UHRF1和HAUSP 蛋白阳性率随着胶质瘤级别增高而增高（P=0.005、0.002），而β-TrCP1 的蛋白阳性率随着胶质瘤级别增高而降低（P=0.003）。具体信息见表1。

三、胶质瘤组织中UHRF1 表达与β-TrCP1、HAUSP表达的相关性分析

相关性分析结果显示，在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中，UHRF1 的Allred 评分均与β-TrCP1 的Allred 评分呈负相关（Ⅰ级：r=-0.903，P=0.000；Ⅱ级：r=-0.930，P=0.000；Ⅲ级：r=-0.895，P=0.000；Ⅳ级：r=-0.920，P=0.000）（图2）。另一方面，在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中，UHRF1 的Allred 评分均与HAUSP 的Allred 评分呈正相关（Ⅰ级：r=0.931，P=0.000；Ⅱ级：r=0.866，P=0.000；Ⅲ级：r=0.803，P=0.000；Ⅳ级：r=0.904，P=0.000）（图3）。

讨论

表观遗传因素在胶质瘤等恶性肿瘤的发生发展中起重要调控作用[2]。UHRF1 作为重要的表观遗传调控因子，其在胶质瘤等恶性肿瘤中的表达水平与临床病例特征的关系以及其异常蛋白水平的维持机制受到关注。

表1 UHRF1、β-TrCP1 和HAUSP 蛋白表达与胶质瘤患者临床参数的关系[例（%）]

图2 在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中UHRF1 和β-TrCP1 的相关性分析

图3 在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中UHRF1 和HAUSP 的相关性分析

本研究发现UHRF1 蛋白阳性率随着胶质瘤WHO 级别增高而增高。Oba-Shinjo 等[8]分析UHRF1在高级别星形细胞瘤中的表达高于低级别星形细胞瘤，与本研究结果一致。已有研究发现UHRF1 在膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞内皆高表达[9]。UHRF1 的表达与胃癌分化程度、TNM 分期、是否存在淋巴结转移和远处转移呈正相关，并且提示患者预后不良。这些研究成果均提示UHRF1 在不同组织肿瘤中均发挥促癌作用[10]。

本研究发现泛素化酶β-TrCP1 蛋白阳性率随着胶质瘤WHO 级别增高而降低。Liang 等[11]发现β-TrCP1 蛋白表达在正常脑组织中呈高表达，而在胶质瘤中呈低表达，在高级别胶质瘤中的表达水平低于低级别胶质瘤，表达水平越低，胶质瘤预后越差，与本研究结果一致。此外，本实验证实胶质瘤细胞中β-TrCP1 与UHRF1 呈负相关，因此笔者推测胶质瘤中UHRF1 蛋白可能是β-TrCP1 的泛素化底物，β-TrCP1 呈低表达导致UHRF1 蓄积引起表观修饰的异常，可能是导致患者预后较差的因素之一。有报道显示结直肠癌组织中β-TrCP1 呈高表达[12]。结合胃癌和胶质瘤中的研究结果，β-TrCP1 的表达具有组织异质性，不同组织中的表达及作用需具体分析。

本研究发现HAUSP 蛋白阳性率随着胶质瘤WHO 级别增高而增高。相关研究报道，HAUSP 在正常脑组织中呈低表达，随着胶质瘤恶性程度升高HAUSP 的表达增加，这与本研究结果一致，表明HAUSP 可能是促进胶质瘤恶性进展的重要因素[13]。此外，本研究证实胶质瘤细胞中HAUSP 与UHRF1呈正相关。由此推测恶性度较高的胶质瘤中高表达的HAUSP 可能通过使UHRF1 蛋白去泛素化增强其稳定性，继而导致基因组因低甲基化而不稳定，是促进细胞恶性进展的因素之一[9]。在肝癌、前列腺癌及乳腺癌中的研究发现HAUSP 在癌组织中呈高表达，且与恶性进展呈正相关[14-16]。此外，HAUSP 的表达与肺癌的病理分型有关，其在肺腺癌中的表达显著低于在鳞状细胞肺癌的表达[17]。由此提示，HAUSP的表达水平与多种肿瘤组织的分级和分型有关。

综上所述，泛素化酶β-TrCP1 在胶质瘤中可能起抑癌作用，去泛素化酶HAUSP 可能起促癌作用。恶性度高的胶质瘤中，β-TrCP1 呈低表达，促使UHRF1 泛素化减少；而HAUSP 呈高表达，导致UHRF1 去泛素化，低泛素化水平使得UHRF1 降解减少，UHRF1 蛋白异常高表达，这可能是导致Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤细胞高度恶性的重要因素之一。本研究为阐明胶质瘤发生发展的表观遗传分子机制和胶质瘤的临床诊疗提供理论依据。