周明敏 刘育 熊亮 权大君 何燕 王晞 唐艳红 黄鹤 黄从新

心脏交感神经系统的过度激活与急性心肌梗死(AMI)后室性心律失常(VAs)发生密切相关[1]。抑制心脏交感神经过度激活的神经再平衡策略已被证明可减少VAs和心脏性猝死[2]。既往研究表明，心脏交感传入反射(cardiac sympathetic afferent reflex, CSAR)是一种由心脏传入信号激活的交感神经兴奋性反射，参与AMI、心力衰竭和高血压等疾病的交感神经异常激活[3-4]。笔者探讨选择性去心脏交感传入神经(selective cardiac sympathetic afferent denervation，SCSAD)对AMI后心脏自主神经功能、电生理学特性以及VAs发生的影响，以期为AMI后恶性室性心律失常的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康成年雄性杂种犬24只(体重18～24 kg)，由武汉大学人民医院动物中心提供。采用随机数字表法将24只犬随机分为3组：对照组(n=8)、AMI组(n=8)和SCSAD组(n=8)。实验用犬均通过3%戊巴比妥钠麻醉，气管插管正压机械通气(MAO01746，美国霍利斯顿哈佛仪器)，持续监测肢体导联心电图(ECG)。维持剂量为戊巴比妥钠2 mg·kg-1·h-1并通过角膜反射、肌张力和皮肤夹捏反射评估麻醉深度。分离右侧股动脉，置入鞘管，连接压力换能器持续监测动脉血压，分离左侧股静脉建立静脉通路持续滴注生理盐水(50～80 ml/h)。左侧第四肋间开胸，剪开心包缝制心包吊桥，充分暴露左心。通过加热垫维持动物体温为(36.5±1.5)℃。所有心电信号和血压信号均通过Lead-7000多导电生理仪系统(四川锦江电子公司)实时采集监测。该研究通过武汉大学人民医院伦理委员会的批准。

1.2SCSAD与AMI模型的建立 SCSAD组通过心外膜给予5 ml 50 μg/ml吐温生理盐水混合液为溶剂的树胶脂毒素(Resiniferatoxin，RTX)(美国Sigma公司)，缝合心包膜确保药物和/或溶剂与心外膜的充分接触并减少挥发。对照组和AMI组犬心外膜涂抹5ml不含RTX的溶剂。AMI组(溶剂涂抹后30 min)和SCSAD组(RTX干预后30 min)通过分离实验犬冠状动脉(简称冠脉)左前降支并于第一对角支以下结扎的方式建立AMI模型。观察ECG急性ST段抬高和T波改变来确认AMI模型建立成功。对照组只分离穿线，不结扎冠脉。

1.3心率变异性(HRV)分析 AMI组与SCSAD组于结扎冠脉后15 min检测HRV，对照组于相应时间检测。使用PowerLab 多导生理记录仪(澳大利亚ADInstruments公司)采集心电数据并使用配套的LabChart 8.1软件分析5 min ECG记录条带的HRV功率谱，分析以下变量：高频(HF)成分(0.15～0.40Hz)和低频(LF)成分(0.04～0.15Hz)以及LF/HF[5]。

1.4VAs的观察 由Lead-7000多导电生理仪系统持续记录AMI组与SCSAD组结扎后1 h ECG，对照组记录分离冠脉后1 h ECG。分析VAs发生情况：室性早搏(简称室早)和室性心动过速(简称室速)发生次数，室速持续时间和心室颤动(简称室颤)发生率。

1.5血清去甲肾上腺素(NE)水平检测 AMI组与SCSAD组在结扎冠脉后1 h于颈外静脉采血，对照组在相应时间采血。采血后以3 000转/分钟离心15 min，取上清液于-80℃保存。使用犬NE酶联免疫检测试剂盒(H096，南京建成生物科技有限公司)测定血清NE水平。

1.6心脏电生理指标的检测 将多极标测电极缝于左心室游离壁，记录结扎冠脉后60 min缺血区和非缺血区(对照组与相应时间记录心尖部、心底部)的局部电图，通过S1S2程控期前刺激分别测量这些部位的有效不应期(ERP)。由Lead-7000发放期前程序电刺激，由连续8个S1S1刺激(周长为300ms)外加1个S2刺激组成，S1S2配对间期从250 ms开始反扫，以10 ms递减，当S2不能夺获心室时，从上一个S1S2配对间期起始以2 ms递减，直至不能夺获心室。ERP定义为未能夺获心室的最长S1S2配对间期。将自制刺激电极缝置于左心耳，采用300 ms固定周长起搏，应用自制Ag-AgCl电极于结扎冠脉后1 h记录缺血区和非缺血区(对照组与相应时间记录心尖部、心底部)的单相动作电位(MAP)，计算MAP复极90%的时程(MAPD90)，并采用S1S1动态起搏法测定缺血区(对照组检测心尖部)动作电位时程(APD)电交替出现的最大起搏周长[6]。相邻MAPD90相差>5%并交替出现10次以上定义为APD电交替。

1.7左侧星状神经节(LSG)功能评价 心脏电生理指标检测完成后，于左侧第2肋间打开胸腔，初步定位LSG后将连接于Grass-S88刺激仪的一根直径0.1 mm银丝插入LSG，在LSG不同部位发放10 V的高频电刺激(频率20 Hz，脉宽0.1 ms)30 s，将刺激时血压升高最明显的部位定义为血压变化最大的位点，在此刺激位点固定银丝，测定不同强度电压刺激(从10 V开始，以10 V逐步递增直至70 V，刺激持续时间30 s)LSG引起的最大收缩压变化百分比(MSBP%)，以此评价LSG功能。

1.8LSG蛋白表达水平的检测 实验结束时，取各组新鲜LSG组织并存放于-80℃冰箱保存备用。应用Western blot分析LSG中c-fos和神经生长因子(NGF)的表达水平。相应的一抗分别是抗c-fos(ab156802，Abcam公司)和抗NGF(bs-10806R，Bioss公司)。以内参GAPDH条带光密度值作为标准,计算c-fos和NGF蛋白表达的相对量。

1.9统计学分析 计量资料均采用均数±标准差表示，3组间比较采用单因素方差分析以及Bonferroni或Tamhane′s T2的事后检验；等级资料使用中位数(四分位数间距)M (QL～QU) ]来表示, APD电交替起搏周长的组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验以及Dunn-Bonferroni事后检验；计数资料以分数表示，室颤发生率的组间比较采用Fisher确切概率法。采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

AMI组5只,SCSAD组1只死于冠脉结扎后的室颤发作(此6只犬仅纳入心室颤动发生率)，其余犬均完成所有实验。

2.1三组HRV的比较 与对照组比较，AMI组LF和LF/HF显著增加(P<0.05)。与AMI组比较，SCSAD组LF和LF/HF明显降低(P<0.05)。与对照组比较，SCSAD组LF亦降低(P<0.05)。见表1。

2.2三组VAs的发生情况比较 与对照组比较，AMI组室早和室速发作次数增多，室速发作的平均持续时间延长，室颤发生率增加(P<0.05)。SCSAD组室早发作次数较对照组增多(P<0.05)，而室速发作次数，室速发作的平均持续时间和室颤发生率两者均无差异(P>0.05)。与AMI组比较，SCSAD组室早和室速发作次数明显减少、室速发作的平均持续时间明显缩短(P<0.05)。见表2。

表1 三组犬HRV和血清NE水平的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与AMI组比较，△P<0.05

表2 三组犬VAs发生情况的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与AMI组比较，△P<0.05

2.3三组血清NE水平的比较 相比对照组，AMI组和SCSAD组血清NE水平升高(P<0.05)，而SCSAD组较AMI组低(P<0.05)。见表1。

2.4三组电生理指标比较 与对照组相比，AMI组左心室缺血区ERP和MAPD90都显著缩短，APD电交替起搏周长显著延长(P<0.05)，而SCSAD组较AMI组ERP和MAPD90延长，APD电交替起搏周长缩短(P<0.05)。与对照组相比，SCSAD组ERP延长(P<0.05)，MAPD90和APD电交替起搏周长二者无差异(P>0.05)。此外，与AMI组相比，SCSAD组左心室非缺血区ERP和MAPD90显著延长(P<0.05)。见图1和表3。

A: 三组犬MAPD90示意图；B～D: 三组犬APD电交替示意图。PCL= APD电交替起搏周长

组别nERP 缺血区 非缺血区 MAPD90 缺血区 非缺血区 APD电交替起搏周长对照组8154.3±7.1155.5±8.3164.6±6.4 164.4±12.7180.0 (172.5～180.0)AMI组8141.9±9.9∗ 155.4±12.6 140.6±17.1∗161.4±8.8250.0 (242.5～260.0)∗SCSAD组8 168.8±10.1∗△ 168.4±6.7∗△162.4±22.1△178.0±13.6△210.0 (190.0～230.0)△

注：MAPD90=单向动作电位复极90%的时程。与对照组比较，*P<0.05；与AMI组比较，△P<0.05

2.5三组LSG功能的比较 与对照组相比，AMI组LSG在相同电压(10～ 40 V)刺激后MSBP%显著升高(P<0.05)，而SCSAD组(20～ 70 V)较AMI组MSBP%减低(P<0.05)。与对照组相比，SCSAD组LSG在相同电压(50 V和60 V)刺激后MSBP%减低(P<0.05)。见表4。

表4 三组犬LSG刺激引起的MSBP%

注：与对照组比较，*P<0.05；与AMI组比较，△P<0.05

2.6三组LSG蛋白表达比较 与对照组相比，AMI组和SCSAD组c-fos蛋白表达显著增加(P<0.05)，而SCSAD组较AMI组c-fos蛋白水平降低(P<0.05)。与对照组比较，AMI组NGF没有显著性改变(P>0.05)，但SCSAD组NGF表达水平较对照组和AMI组均降低(P<0.05)。见图2和表5。

NGF=神经生长因子

组别nc-fos/GAPDHNGF/GAPDH对照组50.19±0.030.52±0.03AMI组50.68±0.03∗0.53±0.06SCSAD组5 0.44±0.04∗△ 0.31±0.06∗△

注与对照组比较，*P<0.05；与AMI组比较，△P<0.05

3 讨论

心脏交感神经和迷走神经张力的平衡失调与心律失常的发生密切相关。现有研究显示抑制心脏交感神经过度激活的神经再平衡策略可减少VAs和心脏性猝死，而已知的自主神经调控手段，大多针对心脏交感神经传出通路，对于交感兴奋启动环节的心脏交感神经传入通路进行干预的研究相对较少[2, 7]。既往研究发现激活CSAR需表达瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)的心脏交感传入神经纤维，而应用RTX可使表达TRPV1的传入神经元和神经纤维快速降解，引起交感传入纤维脱敏，从而抑制CSAR的激活[8-10]。本研究通过心外膜应用RTX，可以阻断交感兴奋的启动环节达到抑制心脏交感神经兴奋的目标，减少AMI后交感神经的过度激活，对于AMI后恶性VAs的发生具有抑制作用。

基础和临床研究显示，心肌梗死后交感神经系统的过度激活是引发VAs的重要机制[11-13]。AMI后心肌各种代谢产物释放，通过刺激心脏交感传入神经末梢(主要是TRPV-1阳性的传入神经纤维)来激活CSAR，导致心脏交感传出神经活性升高。本研究的结果显示SCSAD可以减少AMI后心脏交感神经的过度激活：第一，SCSAD组心外膜RTX预处理显著抑制AMI后LF(nu)和LF/HF的升高；第二，SCSAD显著抑制AMI后血清NE水平的升高；第三，SCSAD对AMI后LSG功能有明显的抑制作用。这些结果提示CSAR对AMI后心脏交感神经的激活起着重要作用，SCSAD可以通过阻断CSAR中交感兴奋的始动环节达到抑制心脏交感神经兴奋的作用。

研究证实自主神经系统可以影响心脏电生理，其中激活交感神经可缩短心室ERP和APD，而抑制交感神经将延长二者[14-15]。在本研究中，我们发现心外膜RTX的应用可以延长AMI后心室ERP和APD,可能与SCSAD后心脏交感神经受到抑制相关。APD电整复假说指出，陡峭的恢复曲线与APD震荡相关，易于导致局部传导阻滞和旋波破裂，促进室颤，而平坦的恢复曲线则具有保护作用[16]。APD电交替可以作为恶性VAs发生的重要预测因素，电交替的发生易于导致陡峭的恢复曲线，促进室颤的发生，而延缓APD电交替的发生则提示恶性VA发生风险的降低[17]。本研究中笔者发现SCSAD可以缩短AMI后APD电交替起搏周长。增加心室电生理稳定性可能是SCSAD抗心律失常发生的机制之一。

交感神经活性的动态变化与神经肽/神经递质的变化密切相关。其中NGF是一种重要的神经营养因子，决定心脏交感神经重构的分布和密度[18]。既往研究表明，NGF可以促进LSG重构并进一步增加缺血相关的室性心律失常[19]。在本研究中，我们发现SCSAD可以下调LSG中NGF蛋白的表达情况。c-fos作为一种神经元广泛激活的标志物[20]，笔者发现SCSAD可以显著抑制AMI后c-fos蛋白表达。SCSAD抑制LSG神经活动和功能可能是通过调节神经递质或神经肽的浓度。

本研究也存在一些局限性。第一，戊巴比妥的麻醉可能会影响自主神经系统，但由于整个手术过程是持续麻醉，且3组均使用相同的麻醉方式尽可能减少影响；第二，我们仅研究心外膜RTX在急性模型中的作用，对心脏电生理以及神经和心脏重塑的长期影响尚需要进一步研究证实。