可见光起搏心脏的在体实验研究

2019-05-05饶盼盼王晞程玥姜婵黄从新

中国心脏起搏与心电生理杂志 2019年2期

饶盼盼王晞程玥姜婵黄从新

2006年, Deisseroth等[1]首次定义光遗传学(optogenetics)概念，即结合遗传学与光学技术进行细胞生物学研究的新技术。利用特定波长的光照激活表达在细胞膜上的光敏感离子通道蛋白，引起细胞内外离子流动，进而达到精细调控靶细胞或靶器官生理功能的作用。该技术首先在神经科学领域迅猛发展，2010年被引入心脏研究领域，成为心电生理研究的一种新手段。其中兴奋性的光敏感离子通道蛋白channelrhodopsin-2 (ChR2)是光遗传学在心脏领域最为常用的光控元件，ChR2在接受470 nm左右的蓝光照射时通道开放，H+、 Na+、 K+、Ca2+等阳离子迅速流入细胞内，引起心肌细胞去极化，产生相应的电生理效应[2]。目前心脏光遗传学多以单个心肌细胞，计算机模型及小鼠离体心脏为对象开展研究，笔者拟建立光遗传学大鼠心脏在体研究模型，为进一步开展生理及病理状态下心电生理及心脏功能研究提供相应模式。研究选择ChR2为心脏光遗传学工具蛋白，以腺相关病毒为载体将ChR2转染表达于SD大鼠心脏上，开展473 nm蓝色可见光在体起搏的有效性及相关参数优选的实验研究。

1 材料与方法

1.1实验材料健康SPF级SD幼鼠27只，由华中科技大学实验动物中心提供，于武汉大学实验动物中心繁殖饲养。腺相关病毒购自和元生物技术股份有限公司。

1.2动物分组及模型制备将实验动物随机分为三组：正常组、ChR2组、空载病毒组，每组9只。分别经颈静脉注射60 μl PBS、60 μl载有ChR2目的基因的腺相关病毒[AAV9-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry]、60 μl空载病毒(AAV9-CAG-mCherry)。所有动物在SPF级环境20～25℃ 恒温饲养，静脉注射8周后，大鼠按3%戊巴比妥钠30 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。行常规气管插管，连接小动物呼吸机，正压通气，潮气量10～15 ml,呼吸频率70 次/分。开胸，充分暴露右心室游离壁。

1.3心电生理评价首先设置473 nm蓝光的脉冲频率为8 Hz，脉冲宽度为20 ms，功率密度为0.64 mw/mm2，以连续30个脉冲照射右心室游离壁，根据同步记录的光输出信号与体表心电图判断心脏节律是否被光脉冲夺获。对能够被光照夺获的大鼠进行下一步实验研究。固定光照频率8 Hz，脉冲宽度20 ms，改变光照功率密度(0.03～1.97 mw/mm2)，30个连续脉冲后间隔5 s重复照射右心室2次，观察光照不同功率密度对心脏夺获率的影响。夺获率为成功夺获心律的光脉冲个数与光脉冲发放总数之比。固定光照频率8 Hz，改变脉冲波宽(2、5、10、20、50 ms)和功率密度(0.03～1.97 mw/mm2)，给予30个脉冲光照并重复2次，比较在不同脉冲波宽的条件下，光照完全夺获起搏心脏所需的最小功率密度(光起搏功率密度阈值)。以频率8 Hz ，脉冲宽度20 ms和相应的2倍光起搏阈值蓝光照射右心室，脉冲光照完全夺获心脏节律，比较光照前、光照时、光照后心电图RR间期、QRS波宽、QT间期是否存在差异。光输出信号与体表心电图均由Powerlab生理记录仪(AD Instrument)同步记录，以Labchart软件进行分析。

2 结果

2．1蓝光起搏心脏夺获率研究蓝光照射ChR2组大鼠右心室可完全夺获心脏节律，在一定范围内心脏夺获率随光照功率密度的增大而增加，1∶1夺获可至100 %。ChR2组大鼠基础心率为(334±48)次/分，给予30个8 Hz 的473 nm蓝光脉冲照射右心室，光照脉冲信号与心电图QRS波呈1∶1关系(图1)。相同参数蓝光光照正常组和空载病毒组大鼠心脏，心脏节律均未被光照夺获。固定光照频率和脉冲宽度，脉冲光照对心脏的起搏夺获率随蓝光的功率密度增大而增加(图2，在体心脏光起搏实验视频见365医学网,链接http://www.365heart.com/videodata/show.asp?id=1750)。

2.2蓝光起搏右心室阈值研究 473 nm 8 Hz 蓝光起搏SD大鼠心脏右心室，光照脉冲宽度依次增加(2、 5、10、20、50 ms)，完全起搏心脏所需最小光照功率密度(mw/mm2)依次为0.46±0.33、 0.26±0.10、0.18±0.04、0.13±0.04、 0.16±0.07(图3)。

2.3蓝光起搏对心电图的影响采用功率密度为2倍起搏阈值，脉冲宽度20 ms的光照完全夺获心脏节律，光照前与光照后心电图RR间期、QRS波宽、QT间期无显著差异(P>0.05)。光照前与光照时心电图RR间期、QRS波宽存在显著差异(P<0.05) ，但QT间期无显著差异(P>0.05)(图4，表1)。

标志光照开始

图2不同功率密度8 Hz 20 ms蓝光光照ChR2组大鼠右心室心脏夺获率比较

3 讨论

本研究利用载有ChR2目的基因的重组腺相关病毒9型，通过静脉注射的方式，完成光敏感蛋白ChR2在SD大鼠心脏的表达并实施心脏光起搏的在体研究。证实473 nm蓝光脉冲光照右心室，可成功起搏心脏，停止光照后心脏电生理特性迅速恢复，2倍起搏阈值光照对心电特性无明显影响。并且初步摸索了473 nm蓝光在体起搏SD大鼠心脏的相关光照参数及其之间的关系。心脏夺获率在一定范围内与光照的功率密度成正相关关系，而光起搏功率密度阈值在一定范围内与光脉冲宽度成负相关关系。

光敏感蛋白ChR2是本研究的重要光学元件，由737个氨基酸组成，是一个7次跨膜的非选择性阳离子通道蛋白[3]。ChR2在光谱中的吸收峰值在470 nm左右，对活化光谱有毫秒级的响应速度。在相应波长的光照下，ChR2迅速发生光学异构反应，ChR2中的全反式视黄醛转变为13-顺视黄醛，继而通道开放。细胞外H+、 Na+、 K+、Ca2+等阳离子内流，引起细胞去极化兴奋。2003年，Nagel等[4]第一次将ChR2引入细胞研究，通过质粒瞬时转染的方式成功将ChR2表达在爪蟾卵母细胞、HEK293和BHK细胞上，并进行了ChR2膜片钳的相关研究。2010年，Arrenberg等[5]和Bruegmann等[6]先后将ChR2用于斑马鱼及转基因小鼠的心脏研究。2015年Vogt等[7]通过颈静脉注射腺相关病毒AAV9-CAG-hChR2(H134R)-mCherry的方式，成功将ChR2表达在野生型小鼠心脏上，并验证蓝光起搏离体心脏的有效性。2015年，Nussinovitch等[8]通过心脏局部多位点注射腺相关病毒AAV-CAG-ChR2-GFP，使ChR2在SD大鼠心脏多位点表达，并进行心外膜上两点同时起搏的相关研究。2016年，Bruegmann等[9]利用470 nm蓝光光照表达ChR2的转基因小鼠心脏心外膜成功除颤并进行人类心脏光除颤的计算机模拟实验，初步探索其可行性。近年来光遗传学技术作为一种新的研究手段，逐步显示出在起搏、除颤、再同步化等研究的优势，但是在体研究模型仍较缺乏，限制了病理状态下该技术用于机制和治疗研究的探索。因此，本研究尝试通过静脉注射的方式使ChR2在大鼠心脏系统性表达，并采用473 nm蓝光光照验证大鼠在体模型的有效性，且均取得初步成功。

光遗传学技术因其在遗传学与光学结合的技术特点，使心脏光遗传研究具有以下优势：①细胞选择性。通过基因编辑技术，将光敏感蛋白基因序列与特异性启动子相融合，能够使光敏感蛋白在心脏特殊类型或亚类细胞上表达[10-11]，为明确心脏中每种细胞类型在心电生理中的作用提供了新的手段；②非扩布性。光遗传学技术是通过光照驱动细胞内外离子流动，达到控制细胞兴奋性目的。通过控制光斑大小，能够精确兴奋细胞数量。与电刺激相比，具有高时空精准性特点[12]； ③ 灵活性。光照无需特殊传导介质，在空气、液体中即可传播，无需与心脏接触即可达到光控目的，结合心脏不同部位光照顺序及路径的程序性调控，使光照模式具有非接触的灵活性特点[13]；④ 光的穿透性。近几年，神经科学领域有学者利用近红外光较强的组织穿透性，利用上转换纳米材料将980 nm左右的近红外光转换成470 nm左右的可见光，进行穿透组织的光遗传学研究[14-16]，为心脏无导线起搏甚至体外起搏提供了一种新思路。当然，光起搏向临床的转化，还需要突破很多难题[17]。但作为一种新技术，为心脏领域的科学研究提供了新的可能。