张振巍，崔璀，张娜娜

(1.中国人民解放军第一五五中心医院，河南 开封 475003； 2.河南应用技术职业学院，河南 开封 475000； 3.开封市中医院，河南 开封 475000)

白细胞减少在临床放、化疗中较为常见，治疗中多采用粒细胞集落刺激因子类药物，但该类药物价格昂贵，不良反应较大，可引起骨痛、发热、白细胞减少等不良反应，有些药物还可能刺激某些恶性肿瘤的生长。因此，寻找治疗白细胞减少症的低毒高效药物成为近几年研究的热点。植物多糖类大分子成分能激活免疫受体，提高机体免疫能力，并且毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好,在临床研究中得到深入发展。为拓展植物药在临床的应用范围，中药组分对机体免疫的作用在近几年研究中逐渐深入，但也有些非多糖类成分对白细胞减少症有着积极的治疗作用，如鸡血藤[1]有效部位群(总黄酮类成分)在4.05 g/kg的给药剂量以上对环磷酰胺(CTX)致白细胞低下的大鼠有较好的升白作用，与空白组比较无统计学意义，说明鸡血藤黄酮类成分能有效拮抗免疫抑制大鼠的白细胞减少。六月青皂苷类成分可显著提高CTX免疫抑制模型小鼠的特异性及非特异性免疫反应，提高其免疫力[2]。前期研究中,课题组发现茜草总蒽醌(TAR)能明显促进机体免疫、延长免疫抑制小鼠生存时间，基于此，本研究从保护白细胞减少为基础，探讨茜草总蒽醌对环磷酰胺诱导小鼠白细胞降低的保护作用及其可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠18～22 g，购自河南省动物实验中心。雌雄各半。实验动物许可证号:SCXK(豫)2013-0002，普通饲料喂养，自由饮水，温度控制在19℃～25℃，相对湿度为30%～70%。

1.2 药品与试剂

环磷酰胺注射液(CTX，江苏恒瑞药业有限公司，批号为H32020857)；大鼠抗小鼠CD34+抗体(美国CALTAG公司)；血清粒细胞集落刺激因子(G-CSF，南京建成生物工程公司，批号为0504191)。地榆升白片(成都地奥集团天麻药业股份有限公司，批号为13080627,0.1 g/片)。茜草总蒽醌(Total Anthraquinone ofRubiaCordifoliaL.,TAR)的制备：取茜草饮片500 g，加入10倍量乙醇，连续回流提取3次，每次1.5 h，减压回收乙醇，用石油醚萃取，除去醚溶性成分，再将醇浓缩液用氯仿-乙酸乙酯(1:2)萃取2次，合并萃取液，真空干燥即得茜草总蒽醌[3]。

1.3仪器

XSP-C204型生物显微镜(重庆光学仪器厂)；AY120电子天平(SHI-MAZDU公司)。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备

取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、地榆升白组(简称阳性组，临用前研成细粉，用生理盐水配制成浓度为0.1 g/15 mL的混悬液，实验给予100 mg/kg剂量)和茜草总蒽醌高、低剂量组(简称高、低剂量组，用量分别为120 mg/kg、60 mg/kg)，除正常组外其余各组小鼠均腹腔注射等剂量的环磷酰胺100 mg/kg，连续3天，每天1次，复制白细胞减少动物模型[4-5]。

2.2 外周血WBC测定

小鼠末次给药后30 min，眼眶静脉丛取血，按照常规方法在低倍显微镜下计数。

2.3 BMC测定

小鼠脱臼处死，分离并取出右侧股骨中断7 mm，用3%乙酸溶液冲出骨髓细胞，在血细胞计数盘上计数四个大方格的细胞数，然后乘以2.5×104，即得1根股骨中骨髓有核细胞总数[6-7]。

2.4 CD34+细胞检测

参照文献[1]方法检测：用含牛血清白蛋白浓度为0.2 %的磷酸盐缓冲溶液冲出小鼠左侧股骨骨髓细胞，取1×106个细胞加入30 μL正常小鼠血清以封闭非特异结合位点，加入10 μL FITC标记的CD34+抗体，对照管中加入相应的对照抗体，4℃避光反应30 min，加入2 mL红细胞裂解液，反应5 min后，冲洗2次，加入浓度为3 μg/mL的碘化丙啶染液，采用流式细胞仪进行检测。

2.5 脾脏指数和胸腺指数检测

小鼠处死后，取出各组小鼠的脾脏和胸腺，分别称重后计算脏器指数。

脏器指数=脏器重量/体质量

2.6 脾集落形成单位(CFU-S)检测

参照相关文献[8-9]，各组小鼠脱臼处死后，取出脾脏，去除筋膜，称重后固定于Bauin染液中，24 h后镜下观察、计数。

2.7 血清G-CSF活性测定

将每组小鼠的血液常温下静置30 min后，离心15 min，3 500 r/min，取上清液，按照试剂盒说明测定G-CSF活性。

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 茜草总蒽醌对CTX致小鼠WBC、BMC细胞及脏器指数的影响

由表1可以看出：模型组的WBC、BMC细胞及脏器指数等指标均低于正常组(P<0.05)，说明CTX对小鼠免疫应答出现抑制状态，提示模型复制成功。阳性组和茜草总蒽醌的高、低剂量组对CTX致小鼠WBC、BMC细胞及脏器指数均有不同程度改善，与模型组比较均有显著性差异(P<0.05)；其中高剂量组的TAR对WBC的恢复能力优于BMC，升高免疫抑制小鼠WBC数量与正常组相当，稍低于正常组，统计学对比显示没有显著性差异(P>0.05)；TAR高、低剂量组能显著对抗CTX致小鼠免疫器官萎缩的症状，即提高免疫抑制小鼠免疫器官指数，且高剂量组明显优于低剂量组治疗效果(P<0.05)，说明茜草总蒽醌对抗CTX致小鼠白细胞降低呈现剂量依赖作用；提示TAR对免疫器官有较好的保护作用，并能积极恢复CTX致小鼠的免疫抑制状态。

表1 各组对CTX致小鼠WBC、BMC细胞及脏器指数影响

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，◇P<0.05。

3.2 茜草总蒽醌对CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF的影响

正常状态下机体造血主要由骨髓承担，脾脏只是肩负造血的储备功能，因此脾脏指数、CFU-S指标并不高，模型组的CFU-S指标较正常组明显下降(P<0.05)，说明小鼠造血组织大量破坏、萎缩，这与脾脏指数降低相一致。CD34+抗原阳性率反映出小鼠造血干/祖细胞数量的变化，由表2可以看出：阳性组和TAR高、低剂量组均能大幅度的提升CD34+抗原阳性率，高剂量的TAR对其提升水平甚至高于正常组，与正常组比较有显著性差异(P<0.05)，提示TAR高剂量时能迅速恢复小鼠体内造血干细胞的造血功能，使造血干/祖细胞数量增加；此调控作用与G-CSF响应相一致，从多角度反应了TAR对CTX致小鼠白细胞降低的保护作用可能与其能快速恢复造血干/祖细胞数量，增加CD34+、CFU-S、血清G-CSF指标有关。

表2 各组对CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF指标影响

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，◇P<0.05。

4 讨论

CTX是一种细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药物和免疫抑制剂，其杀伤肿瘤细胞的同时也可对正常组织细胞造成伤害，如淋巴细胞、造血干细胞等，从而造成免疫功能及造血功能低下。本实验中，小鼠连续腹腔注射3天100 mg/kg，小鼠白细胞数、骨髓有核细胞数、免疫器官质量均明显低于正常组(P<0.05)，说明模型复制成功。地榆升白片是中成药制剂，君药是地榆，从其化学成分的角度来看，主要含有皂苷、鞣质、黄酮类成分，具有止血、抗菌消炎、促进伤口愈合等作用。研究表明该制剂能显著改善骨髓微循环的造血环境，促进骨髓造血干细胞增殖及分化，并能显著改善免疫抑制小鼠的外周血白细胞数量[10]，因此实验中选择该成药作为阳性对照药物进行实验。

CD34+是20世纪80年代中期由美国科学家发现的一种细胞表面分子，其在正常骨髓单个核细胞中约占1%～4%，因此CD34+是造血干细胞特异性的表面标记物，在临床上，通常采用流式细胞仪对CD34+造血干细胞计数以评估骨髓动员效果[11]。CD34+抗原选择性表达于小鼠早期造血干/祖细胞膜表面，并随细胞分化成熟而减少至消失，是小鼠造血干/祖细胞的表面标志，其数量的变化能反映出小鼠造血干/祖细胞的数量；从实验结果来看，模型组CD34+细胞与正常组比较阳性百分率大幅度下降(P<0.05)，说明模型复制成功；高、低剂量的茜草总蒽醌有不同程度的升高CD34+细胞的作用，高剂量的TAR组阳性率较正常组高，提示TAR能增加造血细胞的分化，促进细胞因子分化、成熟[12]。G-CSF是正常造血细胞的增殖分化过程中一种重要的造血正性调控因子，能促进骨髓粒系、单核细胞系、巨噬细胞系发育和成熟，增加外周血成熟粒细胞、单核巨噬细胞功能的一种细胞因子[13-14]；数据显示，阳性组和TAR高、低剂量组均能不同程度的提升G-CSF水平，且TAR高剂量组与阳性组作用强度相当，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)；提示TAR能促进造血调控因子的分化，对造血细胞的功能恢复有积极促进作用，提升免疫抑制小鼠的免疫能力，对抗CTX诱导的免疫抑制，这可能是TAR升高白细胞、促进骨髓造血系统恢复的机制之一。

外周血白细胞计数是肿瘤化疗过程中常规检查指标之一，反映了放疗、化疗对骨髓的抑制程度和机体免疫状态；实验结果显示，模型组的WBC计数较正常组低，并有统计学意义(P<0.05)，说明模型复制成功。阳性组和高、低剂量的TAR能明显对抗CTX致小鼠白细胞的降低(P<0.05)，TAR的对抗作用呈现剂量依赖关系。骨髓有核细胞(BMC)包含了粒系、红系、巨核系的祖细胞，其计数在一定程度上反映了骨髓造血细胞的增生情况，实验表明，TAR能升高CTX致小鼠的BMC降低，说明TAR可能通过刺激骨髓造血功能增加血液白细胞数量[15]。脾脏、胸腺是机体重要的免疫器官，同时脾脏还有一定的造血功能，当骨髓功能受损时，脾脏可代偿性髓外造血。实验结果表明，TAR高、低剂量组可明显拮抗CTX导致的小鼠免疫器官质量降低(P<0.05)，提示TAR能促进骨髓造血，对模型小鼠的免疫器官能起到有一定的保护作用。CFU-S是脾脏造血干细胞在脾脏表明产生细小的颗粒状突击，即为脾结节；实验结果显示TAR高、低剂量组对造血干/祖细胞的数量和增殖能力有保护作用，这与WBC和BMC检测结果相一致。

综上所述，茜草总蒽醌(TAR)可显著对抗环磷酰胺诱导的小鼠白细胞降低作用，其作用机制可能与TAR诱导刺激骨髓造血功能恢复，引导造血调控因子分化，增加血液白细胞数量有关；同时TAR还能刺激机体的免疫器官，促进脾脏造血干细胞脾结节的产生，进而机体自身抵抗力，发挥对白细胞的保护作用。