姚尧，赵路，李军珂

(郑州市妇幼保健院，河南 郑州 450053)

近年来随着生活节奏加快及饮食结构的调整，糖尿病的发病率逐年递增，据统计截止2017年底我国糖尿病人口约2亿人。糖尿病患者常有“三多一少”的症状，及多饮多食多排但体重下降，在病理生理表现上不仅表现为血糖升高，同时影响蛋白质和脂肪的代谢[1]。并且血糖持续异常增高，同时由于其对肠道细胞的影响也间接改变了患者体内肠道菌群的生长环境，以及增殖所需要的必要营养物质发生改变。中医将糖尿病归为消渴症范畴，提出“养阴生津、平衡阴阳”为主的疗法，与传统西医治疗相比较可以减少药物不良反应，在临床上常与西药搭配使用，效果显著。据《神农本草经》记载， 铁皮石斛具有“补五脏虚劳羸弱、强阴”功效，可用于阴伤津亏，口干烦渴等，可以改善患者饮食过度，消耗过大的情况，并有利于改善其体内糖类代谢[2]。为探讨铁皮石斛水提取物对糖尿病小鼠肠道微生物及脂类代谢的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验药物

铁皮石斛根由浙江中药材基地提供。洗净后，机械粉碎，使用95%乙醇室温下溶解提取，提取物再于沸水中浸浴3 h，最后蒸发浓缩，于冰柜中冷冻得铁皮石斛水提物。

1.1.2 主要试剂

1)1% STZ(链脲霉素)：由2.1 g柠檬酸溶于100 mL ddH2O配得柠檬酸母液，由2.94 g柠檬酸三钠溶于100 mL ddH2O配得柠檬酸三钠母液。使用前将柠檬酸母液和柠檬酸三钠母液按照1∶1.32比例配置，避光，冷藏条件下保存。2)总胆固醇(TC)试剂盒(湖南永和阳光科技有限责任公司，产品标准编号为YZB/湘0065-2006)；甘油三酯(TG)试剂盒(湖南永和阳光科技有限责任公司，产品标准编号为YZB/湘0066-2006)；高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒(湖南永和阳光科支有限责任公司，产品标准编号为YZB/湘0067-2006)；低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒(湖南永和阳光科技有限责任公司，产品标准编号为YZB/湘0068-2006)。3)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)。4)TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)是由Tris(三羟甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA。5)蛋白酶K 、溶菌酶 、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇 、70%乙醇、丙酮、 10% SDS(十二烷基硫酸钠)。6)HhaⅠ酶：识别位点 GCG^C、C^GCG；RsaⅠ酶：识别位点GT^AC、CA^TG；Hind Ⅲ酶：识别位点A|AGCTT。

1.1.3 主要试验仪器

PCR仪、-80℃低温冰箱(海尔 BW-86L388)、冷冻离心机(Eppendorf，Centrifuge 5415R)、全自动生化仪(Siemens-Advia2400型，德国拜耳)和电热恒温培养箱(上海精密实备有限公司，DNP-9162)。

1.2 实验动物

1.2.1 动物选择

浙江大学医学院实验动物中心提供小鼠60只(经过动物伦理委员会审批和同意)，体质量18～22 g，均为雌性。保持饲养房通风良好， 灯光照明12 h/d，温度21℃～26℃，湿度60%～70%。

1.2.2 模型制备

参照相关文献[3]，小鼠60只,在适宜温度和光照下饲养1天观察有无异常表现小鼠。从中随机选10只小鼠作为正常对照组。剩下的50只小鼠禁食12 h后按每公斤体质量向小鼠腹腔内注射 STZ(链脲霉素)溶液120 mg 。随后每天上午10点开始给小鼠腹腔内注射 STZ溶液，共注射3 d，第 4天测小鼠空腹血糖值，数值未达到要求的小鼠继续属蛇STZ 溶液2天，按每公斤体质量小鼠注射100 mg。第 6天时停止喂养饲料12 h后，再次测量小鼠空腹血糖值，当数值超过11.1 mmol/L时为合格模型小鼠。数值未达到的小鼠淘汰出组，最后剩余小鼠41只。

1.2.3 实验动物分组

建模成功的小鼠中随机选取10只作为模型对照组，10只为铁皮石斛水提取物高剂量组(6 g/mL)、10只为铁皮石斛水提取物低剂量组(1.5 g/mL)。

1.3 实验方法

正常对照组和模型对照组的小鼠采用普通饲料正常喂养，同时每天灌胃0.2 mL生理盐水。铁皮石斛水提取物高剂量组和低剂量组(6 g/mL、1.5 g/mL)，在正常饲料喂养基础上，每天在0.2 mL生理盐水中各加入1.2 g和0.3 g铁皮石斛提取物，将其灌入小鼠胃中，1次/d，连续给药21 d。实验过程中，所有小鼠均自由喂水，饮用蒸馏水。每5只老鼠饲养于一个笼子中，每3 d更换一次垫料，保持笼内卫生清洁。

1.4 检测指标

1.4.1 小鼠脂类代谢检测

实验用药结束后，停止喂养饲料8 h但是仍提供清洁水。取小鼠眼球后血液，注意保证取血时捆绑好小鼠四肢，防止血液被污染。取约1.5 mL血液于EP管中，静置30 min，再冷藏。隔天将血液进行离心，时间10 min，离心机转速为3 000 r/min,结束后取其上层透明血清。使用仪器测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。

1.4.2 肠道微生物检测

1)小鼠肠道微生物提取：检测完血清脂代谢物后，4组小鼠采用颈椎脱臼法处死并置于无菌工作环境中，无菌采集各组盲肠段内容物，同组随机将小鼠两两分组，收集其肠内容物，充分摇匀过程中注意保证内容物不受污。每组共 10只小鼠，5个重复。立即保存在-20℃的冰箱中。

2)小鼠肠道微生物检测[4]：在保证样本不受污染的情况下取约0.1 g小鼠肠道内容物。按照分组将标本装入个样本瓶中，并在瓶中放入无菌玻璃珠帮助振荡。摇床振荡时间为35 min，频率采用160 rpm。 样本得到彻底振荡后，将样本与各个菌群及稀释液混合培养， 其中样本和大肠菌群在 37℃ 培养箱中培养48 h后计算其菌落数量，真菌则为32℃培养温度，时间延长至96 h，乳酸菌和双歧杆菌培养温度不变，培养环境中将空气抽出，培养时间也为48 h。混合培养每组进行3次，去3次平均值为每克样本中好用的菌落数量。

3)肠道菌群宏基因组提取：参照文献[5]进行。离心管中加入1.0 g样品，过程中注意避免污染。随后使用配置好的0.1 mol/L的PBS溶液，用量为20 mL，和无菌玻璃球一起与样本混合并成分摇匀。离心时间2 min 后取上清，重复以上步骤2次；合并上清液，10 000×g离心8 min，获得沉淀物；沉淀物使用PBS溶液洗涤1次、丙酮洗涤1次后，加入于5 mL TE 缓冲液(pH值8.0)中重新静置，用于下步操作。取 500 μL预处理后的样本悬液与40 μL TE缓冲液、5 μL蛋白酶K和20 μL溶菌酶成分混匀，加入无菌离心管。37℃反应30 min后加入30 μL 10% SDS，混匀，保持温度不变再次作用40 min，并且其中每隔10 min 振荡。分别加入100 μL 5 mol/L NaCl，80 μL CTAB/NaCl，混匀，65℃反应10 min。加入等体积 Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)，10 000×g离心3 min，取上清；再加入等体积氯仿:异戊醇(24∶1，体积比)，10 000×g 离心3 min，取上清，重复操作一次。加入1/10体积3 mol/L醋酸钠及2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀12 h。沉淀用95%乙醇洗涤1次，风干后溶于50 μL TE缓冲液，-20℃保存待用。

4)PCR产物限制性酶切片段分析：以 HhaⅠ、RsaⅠ和Hind Ⅲ酶切PCR产物，反应体系为：PCR产物10 μL，ddH2O 12 μL，10×Buffer 2 μL，HhaⅠ、RsaⅠ和Hind Ⅲ酶各2 μL。37℃反应4 h后经1%琼脂糖凝胶电泳、EB染色、凝胶成像仪观察分析。运用Quantity One软件进行条带分析，琼脂糖凝胶上DNA片段按“出现”记为“1”，“不出现”记为“0”，进行统计分析，SPSS20.0、NTSYS-PC软件计算多样性指数和相似系数。

式中，S为物种总数，Pi为第i种物种个体数占群落总个数的比例。

式中，n1为抽样中第1个菌落的个数，n2为抽样中第2个菌落的个数，n3为抽样中第3个菌落的个数，依次类推，N抽样中所有物种的个体总和。

式中，a为某一样品的酶切图谱的条带数目，b为另一样品的酶切图谱 的条带数目；j为两个泳道所共有条带的数目. 完全不同的两个图谱其相似系数0，而完全相同的2 个图谱的相似系数为1。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 铁皮石斛水提取物对糖尿病小鼠肠道微生物菌落数影响

研究发现，模型对照组小鼠肠道内细菌数、大肠杆菌数和真菌数均明显低于正常对照组，而乳酸杆菌和双歧杆菌均明显高于正常对照组；铁皮石斛低剂量组与高剂量组细菌数、大肠杆菌数和真菌数均明显高于模型对照组，乳酸杆菌数则明显低于模型对照组；铁皮石斛高剂量组的双歧杆菌数明显低于模型对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。而低剂量组仅低于模型对照组，差别不显著(P>0.05)。铁皮石斛高剂量组与低剂量组比较，高剂量组大肠杆菌和细菌数均明显高于低剂量组，高剂量组乳酸杆菌和双歧杆菌数则明显低于低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。而高低剂量两组在真菌数量上比较差异不明显(P>0.05)。见表1。

表1 各组糖尿病小鼠肠道微生物菌落数比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与铁皮石斛高剂量组比较，cP<0.05。

2.2 各组小鼠肠道菌群多样性指数与相似性系数结果比较

多样性指数Shannon和Brillouin反映群落中生物种类数量，其数值越大说明群落的复杂程度越高.相似性系数Czekanowski则反映的是群落中生物种类对比度，当其数值升高好，表示对比后两个群落越相似. 经SPSS 20.0、NTSYS-PC 软件软件分析，各组小鼠肠道菌群多样性指数和相似系数，正常对照组和铁皮石斛高剂量组Shannon指数和Brillouin指数均相同，且大于模型对照组和铁皮石斛低剂量组相同的两指数，说明糖尿病小鼠肠道菌群的数量和种类都大幅发下降，尤其是经铁皮石斛低剂量治疗后其数量和种类未得到明显恢复，但提高铁皮石斛剂量则后效果显著，使得肠道菌群的复杂程度重新达到正常组情况。比较各组肠道细菌群落相似性，铁皮石斛高剂量组的相似系数最大，为0.500 0，模型对照组为0.181 8，铁皮石斛低剂量组为0.166 7，说明铁皮石斛高剂量组小鼠肠道细菌群落在细菌类型上与正常组相似度最高，表示高剂量可以较好改善糖尿病小鼠肠道菌群类别。见表2。

2.3 铁皮石斛水提取物对糖尿病小鼠脂质代谢的影响

模型对照组与正常对照组在TC上比较无明显差异，而TG和LDL-C含量均明显高于正常对照组，HDL-C含量则明显低于正常对照组(P<0.05)；铁皮石斛高剂量组与模型对照比较TC、TG、LDL-C含量明显降低，而HDL-C明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而低剂量组与模型对照组比较TC含量明显降低(P<0.05)，其余指标与模型对照组比较差异不显著，见表3。

表2 各组小鼠肠道菌群多样性指数与相似性系数结果比较

表3 各组小鼠血脂指标比较

3 讨论

目前西药治疗糖尿病，调控血糖时副反应发生率较高。而中医在治疗方案上考虑患者全身因素，考虑患者发病后各脏器阴阳情况，既能环境糖尿病患者不适症状，降低血糖，又能保护外周组织，减少并发症的发生[6]。铁皮石斛是我国传统的名贵中药材， 属养阴要药，《中国药典》记载其主归肾经，故可治肾阴虚证，是治疗肾阴虚型消渴症的代表药物[7]。我院通过研究探讨铁皮石斛水提取物对糖尿病小鼠肠道微生物及脂类代谢的影响。

从表1可以看出模型对照组小鼠肠道内细菌数、大肠杆菌数和真菌数均明显低于正常对照组，而乳酸杆菌和双歧杆菌均明显高于正常对照组.这是因为人体内血糖持续升高，可以改变肠道内多种机会致病菌的分布和数量，从而削弱患者肠道抵抗外界环境变化能力，其抵御病原体的微生物屏障被破坏[8]。因此调节患者肠道菌群有利于减少普通降糖药物的副作用，也提高患者生活质量。从我院研究结果可以看出，铁皮石斛低剂量组与高剂量组细菌数、大肠杆菌数和真菌数均明显高于模型对照组，乳酸杆菌数则明显低于模型对照组；铁皮石斛高剂量组的双歧杆菌数明显低于模型对照组。而低剂量组仅低于模型对照组。说明通过治疗使得小鼠体内肠道菌群数量不同程度恢复到正常水平，这与铁皮石斛含有铁皮石斛多糖有关，该多糖在研究过程中被发现无法被部分细菌吸收利用，比如金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，从而导致部分细菌缺少必要营养物质而凋亡。但是它可以被乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌利用吸收，有助于这两种细菌的增殖[9-10]。同时，铁皮石斛中含有丰富的黏液质，可以与胃液一起发挥协同作用，帮助修复肠道中受损的细胞，有利于乳酸杆菌与肠道细胞结合[11]。铁皮石斛中还含有丰富的微量元素，也是乳酸杆菌必需的营养物质[12]。铁皮石斛高剂量组与低剂量组比较，高剂量组大肠杆菌和细菌数均明显高于低剂量组，高剂量组乳酸杆菌和双歧杆菌数则明显低于低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。而高低剂量两组在真菌数量上比较差异不明显。说明提高铁皮石斛剂量可以增加治疗效果，这与Xie SongZi等[13]研究结果相符合。并且从表2 中可以看出，铁皮石高剂量组小鼠肠道细菌群落与正常组最相似，其对糖尿病小鼠肠道菌群改善最好。

糖尿病患者由于体内存在胰岛素抵抗，导致组织细胞能量代谢异常，脂肪和肌肉分解过快，代谢紊乱，从而加重病情[14-15]。从表3中可以看出，模型对照组与正常对照组在TC上比较无明显差异，而TG和LDL—C含量均明显高于正常对照组，HDL-C含量则明显低于正常对照组。铁皮石斛高剂量组与模型对照比较TC、TG、LDL-C含量明显降低，而HDL-C明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而低剂量组与模型对照组比较TC含量明显降低，其余指标与模型对照组比较差异不显著。说明铁皮石斛在降低血糖同时，也有助于改善患者体内脂质代谢，考虑可能与铁皮石斛有抗炎作用有关，可以减少动脉血管因脂代谢异常造成的炎症反应[16]。

综上所述，铁皮石斛水提取物可以有效改善糖尿病小鼠体内肠道菌群，提高其免疫力；并使得小鼠体内脂质代谢恢复平衡，减少动脉粥样硬化发生，尤其是高剂量铁皮石斛水提取物治疗效果更好，下一步可在临床上进一步研究，观察其对糖尿病患者的作用是否和小鼠表现相符合。