杨雅琼，杨宏伟，白雪，王毅，官士珍

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，患者在发病的2年内即可出现骨关节破坏，造成残疾和功能障碍。早期诊断和治疗是防止关节畸形的关键。目前对RA的诊断采用2010年美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）和欧洲抗风湿病联盟（European League Against Rheumatism，EUIAR）联合提出的诊断标准（ACR/EULAR 2010标准）［1］，血清学诊断主要为类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP）、抗角蛋白抗体、抗核周因子等，但仍然有部分患者被漏诊或误诊［2-3］。2007年Kilani等［4］在关节炎患者的关节液中检测到了高水平的14-3-3蛋白。14-3-3蛋白是一种广泛表达于多种真核细胞内的伴侣蛋白家族，包括β、ε、γ、η、τ、ζ和σ7种亚型，血清和关节液中存在14-3-3γ和14-3-3η两种亚型，其中后者是主要的亚型［4］。Maksymowych等［5］发现，RA患者血清中14-3-3η水平高于健康对照组和疾病对照组，包括其他关节病、结缔组织病和自身免疫病。本文拟探讨14-3-3η、anti-CCP、RF相互组合的检测方案，包括平行试验（串联试验）与系列试验（并联试验）对RA的诊断效能。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2016年12月—2017年9月在天津市天津医院住院的RA患者，所有患者符合ACR/EULAR 2010标准。记录患者病史，包括病程、发病及进展情况。拍摄双手及腕X线片，检查肿胀关节数（SW28）、触痛关节数（T28），检测红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）等指标，计算28个关节的疾病活动性评分（Disease Activity Score 28-joint count，DAS28）。排除严重糖尿病、高血压、心脑血管疾病、感染、肝肾疾病、肿瘤及其他慢性疾病的患者。患者在确诊前均未进行改善病情的抗风湿药物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs）治疗。

RA组患者94例，年龄26～87岁，病程0.3～480个月，其中男23例，女71例，平均年龄（60.89±11.47）岁。另选择骨性关节炎（OA）患者20例、强直性脊柱炎（AS）患者11例，痛风患者9例，为疾病对照组，其中男16例，女24例，平均年龄（56.30±12.89）岁。健康对照组40例，为同期我院体检健康者，男15例，女25例，平均年龄（58.50±14.62）岁。各组间年龄（F=1.960）、性别（χ2=4.177）差异均无统计学意义（均P＞0.05）。所有研究对象签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 14-3-3η蛋白检测试剂采用CUSABIO-进口分装试剂，anti-CCP试剂为德国AESKULISA RA/CP-Detect试剂盒，14-3-3η蛋白及anti-CCP检测仪器均为TECAN SUNRISE酶标仪。RF检测所用仪器为BECKMAN COULTER公司IMMAGE 800及其配套试剂。

1.3 检测方法 受试者于清晨采集空腹静脉血分别置于含分离胶的真空采血管中，静脉血标本于3 500 r/min离心15 min，分离血清，用于14-3-3η、anti-CCP及RF的检测。14-3-3η蛋白及anti-CCP检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法，根据 ROC 曲线，14-3-3η 蛋白≥1.44 μg/L、anti-CCP≥14.12 U/L为阳性，RF采用散射免疫比浊法，RF≥20.05 U/L为阳性。检测方案根据检测项目的数量分为单项目组合、双项目组合、三项目组合。并联试验是同时做几个试验，其中有一个试验呈阳性结果，就可以认为有患病的证据；串联试验是依次相继做几个试验，只有所有试验均阳性，才能做出阳性诊断。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验。采用四格表计算3种抗体单独检测及联合检测对RA诊断的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RF、anti-CCP及14-3-3η检测各方案阳性率的比较 双项目组合共有6个方案，三项目组合有9个方案，与单项目一起共有18个方案。将RF、anti-CCP及14-3-3η单一及联合检测方案在RA组、疾病对照组、健康对照组及非RA组（疾病对照组和健康对照组）阳性率进行比较，RA组各检测方案的阳性率与疾病对照组、健康对照组比较均有明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 各联合方案对RA的诊断价值 检测94例RA患者，40例疾病对照组患者和40例健康对照组血清中3项检测指标，采用单一及联合检测方案分析对RA的诊断效能，发现单项目检测方案中，anti-CCP的敏感度最高（84.0%），双项目检测方案中，14-3-3η与anti-CCP并联方案的敏感度最高（97.9%），3项目检测方案中，14-3-3η、anti-CCP与RF并联方案的敏感度最高（98.9%）。RF、anti-CCP、14-3-3η检测各方案分析的敏感度、特异度、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、准确度及约登指数（Youden’s index，YI）见表2。

Tab.1 Comparison of positive rates of single and combined detection of serum RF,anti-CCP and 14-3-3η protein表1 血清RF、anti-CCP及14-3-3η单一及联合检测方案阳性率的比较

3 讨论

RA患者的血清中存在多种自身抗体［6-7］。RF的敏感度较高，但是特异度较差，在很多其他疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征、脊柱关节病中也会出现，甚至在老年人中也有一定程度的升高。2000年Schetlekens等［8］通过ELISA方法对anti-CCP进行测定发现，anti-CCP对RA（包括早期RA）有高特异度，提示了其在RA预后评价中的价值。2010年anti-CCP被纳入ACR/EULAR诊断标准［1］，作为诊断RA的血清学指标。但是仍有部分患者诊断困难，寻找RA相关指标，提高RA诊断的敏感度、特异度，实现早期诊断、早期治疗是阻止RA病情发展和降低致残率的关键。

Tab.2 The diagnostic value of single and combined detection of serum RF,anti-CCP and 14-3-3η protein for RA表2 血清RF、anti-CCP及14-3-3η单一及联合方案对RA的诊断价值

14-3-3蛋白首次发现于牛脑细胞中，有200多种蛋白能够与14-3-3蛋白结合，其参与了细胞凋亡、细胞信号转导、蛋白跨膜转运、环境应答、细胞分裂等领域［9-11］。2007年Kilani等［4］发现在炎性关节疾病患者的关节液和血清中14-3-3蛋白的η和γ 2个亚型增高显著，以η亚型为主，且14-3-3η蛋白水平与基质金属蛋白酶（MMP）-1和MMP-3显著相关，说明14-3-3η很可能与关节损伤有关。另外，关节液中14-3-3η水平比血清中高出5倍，说明这种生物标志物可能源于滑膜。Maksymowych等［12］使用与RA患者血清水平相当的14-3-3η蛋白可激活关键细胞信号级联反应，导致促炎细胞因子以及与关节损伤过程相关因子的转录。Maksymowych等［5］和Carrier等［13］报道14-3-3η与疾病严重程度有关。在多因素研究中，14-3-3η可作为预测RA病情进展的独立因子［14-15］。另有研究报道，14-3-3η可作为RA患者出现骨质疏松的预测指标［16］。

目前对RA的管理标准已经上升到早期诊断并阻止关节痛发展为明显的RA。所以实验室诊断指标需特别注重敏感度，同时兼顾特异度。本研究中，临界值的界定采用ROC曲线法，选择“敏感度+特异度”最高时的值作为临界值。其中anti-CCP的临界值为14.12 U/L，与试剂说明书给出的参考区间（0～12 U/L，12～18 U/L为灰区）基本一致；RF的临界值为20.05 U/L，与试剂说明书给出的参考区间（0～20 U/L）一致；14-3-3η蛋白的临界值为1.44 μg/L，这个指标尚未应用于临床，说明书未给出参考区间，国外文献报道的临界值为 0.19 μg/L［5］，国内文献临界值有的采用0.721 μg/L［17］，有的采用2.59 μg/L［18］，可能与所用的试剂盒不同有关。根据本研究得出的临界值，各检测方案在RA组与非RA组，RA组与疾病对照组、RA组与健康对照组之间比较，阳性率差异均有统计学意义（P＜0.05），说明这些方案对于RA的诊断均有一定价值。在单一指标检测时anti-CCP的准确度及约登指数均比RF和14-3-3η高，在RA的诊断中具有突出的价值，与之前的研究结果一致［18-20］。两项目联合时，anti-CCP无论与RF并联还是与14-3-3η并联均可提高敏感度，但与RF并联时特异度较好，准确度及YI最高，是较为理想的项目组合。当采用anti-CCP、RF和14-3-3η三项目组合时，方案3.2、3.3、3.9的准确度和YI较高，同时又有较高的敏感度，是比较理想的组合方案。

总之，为了提高RA患者的早期诊断率，在条件允许的情况下，最好对3种指标进行联合检测。如果选择单项目方案，anti-CCP的敏感度、特异度、准确度、YI均最高，是最好的指标；如果选择双项目组合，anti-CCP和RF仍为较理想的项目组合，尤以两者并联方案为佳，可获得较高的准确度和YI。三项目组合中方案3.2、3.3、3.9的准确度和YI较高，同时又有较高敏感性，是较为合理的组合方案，对RA的诊断有较好的临床价值。