李玉琴，施建平，金怒云，步丽梅，王凯，田培营

结肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一，全球每年发病例数超过100万，且大多数CRC患者确诊时已发展到疾病中晚期，即使进行手术和放化疗，远期生存率仍不乐观［1］，所以从细胞分子生物学角度寻找抑制结肠癌发生、发展的方法具有一定临床意义。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是前列腺素E2合成的限速酶，通过介导磷酸肌醇3激酶/磷脂酰肌醇依赖性激酶1/蛋白激酶 B（phosphoinositide-3 kinase/phosphoinositide-dependent kinase 1/protein kinase B，PI3K/PDK1/AKT）信号通路，从而促进结肠癌发生，被视作潜在的治疗靶点［2］。新化合物OSU-03012是COX-2抑制剂Celecoxib的衍生物。研究显示，OSU-03012可在不损伤正常组织的情况下杀灭肿瘤细胞［3］。本研究拟从体外研究OSU-03012对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其分子机制，从而为拓展OSU-03012的抗肿瘤治疗谱和研发结肠癌新的治疗策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人结肠癌细胞株HCT-116购自中国科学院上海细胞库；DMEM/F-12培养液、胎牛血清购自GBICO公司；Annexin V-FITC试剂盒、Trizol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自Takara公司；鼠源B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购自美国Abcam公司；CCK-8试剂盒、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记山羊抗小鼠IgG、花青素（cyanidin3，Cy3）标记山羊抗小鼠IgG等二抗购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 人结肠癌细胞株HCT-116以含有10%胎牛血清的高糖培养基，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%时，换不含血清的DMEM高糖培养基。分别用1、3、5和10 μmol/L OSU-03012干预（分别命名为1 μmol/L组、3 μmol/L组、5 μmol/L组和10 μmol/L组），以等体积二甲基亚砜（DMSO）处理的细胞作为对照组。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖情况 HCT-116细胞用胰酶消化后离心，用完全培养基重悬，接入96孔板中，共4块，每块板铺3×5个孔，5 000个细胞/孔。按1.2.1分组以对应的药物浓度加药，200 μL/孔，对照组加入等体积的DMSO，放入含5%CO2，37℃培养箱中分别培养0、24、48、72 h；到达预定的时间后，每孔加入20 μL CCK-8溶液；37℃、5%CO2细胞培养箱内继续孵育2 h；测定450 nm处光密度（OD）值，计算抑制率。抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值。

1.2.3 划痕实验 Marker笔在6孔板背后用直尺均匀地划横线，每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；在孔中加入约8×105个细胞，接种原则为过夜后融合率达到100%；次日用200 μL枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头垂直，不能倾斜（不同孔之间最好用同一枪头）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养液；对照组加入等体积DMSO、其余处理组以不同浓度的OSU-03012干预；放入37℃，5%CO2培养箱继续培养，0、24、48、72及 96 h时间点取样拍照。

1.2.4 Transwell实验 取生长状态良好的HCT-116细胞，采用不完全培养基培养细胞12 h，使细胞处于饥饿状态，收集细胞，调整细胞浓度至2×105个/mL。Transwell上室中加入150 μL细胞悬液，下室中加入600 μL含不同浓度OSU-03012的培养液，每组设置3个复孔，在培养箱中培养24 h后弃去培养液，用棉签将小室内残留细胞擦净。固定10 min后，采用结晶紫染色20 min并封片。显微镜下（×200）观察穿过滤膜的细胞，随机读取6个视野统计细胞数量。

1.2.5 细胞流式实验 收集分组处理24 h后的细胞，PBS重悬细胞并计数，取（5～10）×104个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀；室温避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置；流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.2.6 荧光共聚焦实验 将分组处理24 h后的细胞接种到预先放置有盖玻片的6孔板中，待细胞密度达到85%～90%后取出盖玻片，PBS洗2次；多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；采用通透剂处理细胞5～15 min，通透后用PBS洗涤3次，每次5 min；使用封闭液封闭细胞30 min，加入一抗，室温孵育1 h，采用加入Tween-20的PBS缓冲液（PBSTween-20，PBST）漂洗3次，每次5 min，加入二抗，室温避光孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min，蒸馏水漂洗1次；封片后，采用荧光显微镜（×200；封片）观察并拍照。

1.2.7 Real-time PCR实验检测Caspase-3和Bcl-2mRNA表达情况 收集分组处理后的各组HCT-116细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书步骤将总RNA逆转录为cDNA，根据SYBR GREEN定量PCR说明书步骤进行PCR扩增。实时荧光PCR扩增条件：95℃30 s；95℃5 s，60℃ 34 s，共42个循环；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。计算各组2-ΔΔCt值，内参基因为GAPDH。各检测基因引物序列见表1。

1.2.8 Western blot检测Bcl-2和Caspase-3蛋白表达情况 收集分组处理后的各组HCT-16细胞，提取细胞总蛋白后，采用BCA法进行蛋白定量，制作SDS-PAGE凝胶，每孔加入蛋白样品30 μg进行电泳，电泳完毕后转膜，再在常温下封闭2 h，加入一抗，低温孵育过夜，膜洗净后，加入二抗常温孵育1 h，膜洗净后，在暗室滴加显影液显影并拍照，采用Quantity one v4.6.6软件分析条带灰度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件分析。符合正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

Tab.1 Primer sequence of each gene表1 各基因引物序列

2 结果

2.1 OSU-03012对HCT-116细胞增殖能力的影响 24、48及72 h时，除24 h 3 μmol/L组与1 μmol/L组比较差异无统计学意义外，抑制率均随浓度增加呈逐渐增加趋势（P＜0.05），见表2。

Tab.2 The inhibition rate of HCT-116 cells after treatment with OSU-03012表2 OSU-03012作用HCT-116细胞后抑制率（n=3，±s）

Tab.2 The inhibition rate of HCT-116 cells after treatment with OSU-03012表2 OSU-03012作用HCT-116细胞后抑制率（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；abc分别与1、3、5 μmol/L组比较，P＜0.05

组别1 μmol/L组3 μmol/L组5 μmol/L组10 μmol/L组F 24 h 0.05±0.03 0.09±0.04 0.32±0.02ab 0.43±0.02abc 121.061＊＊48 h 0.14±0.03 0.29±0.02a 0.38±0.06ab 0.72±0.04abc 111.554＊＊72 h 0.24±0.01 0.38±0.04a 0.56±0.07ab 0.83±0.04abc 94.866＊＊

2.2 OSU-03012对结肠癌细胞迁移能力的影响 不同时间点，各组细胞迁移情况见图1，细胞迁移距离，对照组＞1 μmol/L组＞3 μmol/L组＞5 μmol/L组＞10 μmol/L组。Transwell实验检测结果显示，对照组、1 μmol/L组、3 μmol/L组、5 μmol/L组和10 μmol/L组细胞迁移数目分别为（62±10）个、（51±8）个、（45±6）个、（40±3）个和（23±6）个，呈逐渐降低趋势（n=3，F=12.716，P＜0.05），见图2。

2.3 OSU-03012对结肠癌细胞凋亡的影响 对照组、1 μmol/L组、3 μmol/L组、5 μmol/L组及10 μmol/L组凋亡率分别为（1.86±0.55）%、（3.08±0.33）%、（5.65±0.22）%、（11.20±0.20）%及（20.63±4.23）%，呈逐渐增加趋势（n=3，F=48.120，P＜0.05），见图3。

2.4 免疫荧光检测OSU-03012对Bcl-2和Caspase-3表达的影响 1、3、5、10 μmol/L组Bcl-2蛋白表达弱于对照组，而Caspase-3蛋白表达强于对照组，见图4、5。

2.5 OSU-03012对Bcl-2和Caspase-3表达的影响 3、5、10 μmol/L组Bcl-2 mRNA和蛋白表达量低于对照组，而Caspase-3 mRNA和蛋白表达量高于对照组（均P＜0.05），见表3、图6。

Fig.1 The migration ability of HCT-116 cells detected by scratch test(×200)图1 划痕实验检测HCT-116细胞迁移能力（×200）

Fig.2 The migration ability of HCT-116 cells detected by Transwell test(crystal violet staining,×200)图2 Transwell实验检测HCT-116细胞迁移能力（结晶紫染色，×200）

Fig.3 Apoptosis rates of cells detected by cellular flow experiment图3 细胞流式实验检测凋亡率

3 讨论

Fig.4 The expression of Bcl-2 detected by immunofluorescence assay(×200)图4 免疫荧光实验检测Bcl-2表达情况（×200）

Fig.5 The expression of Caspase-3 detected by immunofluorescence assay(×200)图5 免疫荧光实验检测Caspase-3表达情况（×200）

COX-2在前列腺素合成中起关键作用，是前列腺素E2合成的限速酶。COX-2活性增加可促进前列腺素E2合成，进而抑制机体免疫功能，诱导血管生成，诱导K-ras、Bcl-2等促癌基因表达，抑制癌细胞凋亡，利于肿瘤生长［4］。流行病学调查显示，阿司匹林和其他非甾体类抗炎药能通过抑制COX-2活性，使结肠癌发病率、死亡率明显降低［5］。OSU-03012是COX-2抑制剂的衍生物，在人体内生物活性高，虽缺乏COX-2抑制活性，但在动物实验中发现其具有比COX-2抑制剂更强的抗癌作用［6］。另有研究显示，OSU-03012可增强拉帕替尼抗肿瘤作用，而拉帕替尼也可增强OSU-03012的杀灭肿瘤细胞的毒性作用，且两者抗肿瘤具有协同作用，当联合作用于癌细胞时，可协同使AKT和ERK1/2活性降低［7］。本研究结果发现，对照组、1 μmol/L 组、3μmol/L组、5 μmol/L组和10 μmol/L组细胞抑制率呈逐渐升高趋势，细胞迁移距离及细胞迁移数目呈逐渐减小或降低趋势，提示OSU-03012干预后细胞增殖和迁移能力明显受到影响，且OSU-03012浓度越高，细胞增殖和迁移抑制越明显，考虑这可能与细胞周期的阻滞在G0～G1期以及迁移相关蛋白表达抑制有关。

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Caspase-3 protein and mRNA between five groups表3 各组Bcl-2、Caspase-3蛋白和mRNA表达情况比较（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Caspase-3 protein and mRNA between five groups表3 各组Bcl-2、Caspase-3蛋白和mRNA表达情况比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；abc分别与对照组以及1、3 μmol/L组比较，P＜0.05

组别对照组1 μmol/L组3 μmol/L组5 μmol/L组10 μmol/L组F Bcl-2蛋白0.39±0.04 0.34±0.05 0.29±0.05a 0.21±0.04abc 0.15±0.03abc 15.462＊＊mRNA 0.95±0.21 0.86±0.14 0.63±0.12a 0.54±0.15a 0.31±0.12ab 8.540＊＊Caspase-3蛋白0.32±0.04 0.54±0.07a 0.63±0.09a 0.77±0.09ab 0.81±0.11ab 16.694＊＊mRNA 1.05±0.24 1.24±0.20 1.78±0.22ab 1.98±0.26ab 2.35±0.29abc 14.353＊＊

Fig.6 The expressions of Bcl-2 and Caspase-3 detected by Western blot assay图6 Western blot检测Bcl-2和Caspase-3表达情况

细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，凋亡细胞染色质凝集，DNA片段化，被巨噬细胞吞噬，此过程中不产生炎症反应［8-9］。Bcl-2是调节细胞凋亡的主要因子，可抑制细胞凋亡，提高细胞存活率，其作用机制是阻断凋亡信号转导的最后共同通路，从而发挥抑制凋亡作用，对正常细胞周期不产生影响［10-11］。Caspase-3是Caspase家族中的一员，存在形式多为非活性酶原，在凋亡信号作用下激活，可将细胞周期进一步阻滞，最终导致核皱缩、染色体聚集、凋亡小体形成，是细胞凋亡的执行蛋白，常用作细胞凋亡程度的评估指标之一［12］。本研究结果显示，对照组、1 μmol/L组、3 μmol/L组、5 μmol/L组及10 μmol/L组凋亡率呈逐渐上升趋势；整体而言，随浓度增加Bcl-2蛋白表达呈逐渐下降趋势，Caspase-3蛋白表达呈逐渐上升趋势，提示OSU-03012可能通过下调Bcl-2表达，上调Caspase-3表达实现促进结肠癌细胞凋亡作用，且OSU-03012浓度越高，促凋亡作用越明显，其作用机制考虑与OSU-03012抑制PI3K/PDK1/AKT信号通路中PDK1和AKT活性有关。研究显示，被激活的PI3K可激活PDK1，PDK1通过磷酸化使部分活化的AKT达到完全活化的状态，进而间接或直接调控Bcl-2和Caspase-3蛋白表达，发挥促进癌细胞凋亡的作用［3，13］。

综上所述，新化合物OSU-03012抗结肠癌的机制可能与抑制结肠癌细胞增殖、迁移，促进结肠癌细胞凋亡有关，而OSU-03012促进结肠癌细胞凋亡可能通过下调Bcl-2表达、上调Caspase-3表达实现，且其抑制癌细胞增殖、迁移、促进细胞凋亡方面具有一定的剂量依懒性。