陈建梅，杨蕊蕊，刘洪恩，刘洪欣，史文新，刘姣，4△

Janus激酶/信号转导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号转导通路是近年来发现的细胞内信号转导通路，在细胞的增殖、分化以及免疫调节等生物学过程中起重要作用［1］。在STAT家族的7个成员中，对STAT3的研究最为明确。细胞质中的STAT3被JAK2激活后，进入细胞核，可通过对相关基因的直接和间接调控作用促进血管新生，诱导细胞增殖、分化或凋亡［2］。目前，关于JAK2/STAT3与肿瘤的关系受到广泛关注。子宫内膜异位症（Endometriosis，EMS）是育龄期妇女的常见疾病，近年来发病率逐年增高。EMS的发病机制至今不明，但其血管新生、细胞增殖、侵袭等生物学特性与肿瘤相似［3-4］。EMS异位内膜细胞的增殖、迁移和侵袭等可能与STAT3信号通路有关。本研究应用JAK2的特异性磷酸化抑制剂AG490干预JAK2/STAT3的激活，观察大鼠EMS异位内膜的生长情况，明确JAK2/STAT3信号通路是否参与EMS的发病过程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar大鼠，清洁级，雌性，体质量180～200 g，购自河北省实验动物中心，实验动物使用许可证：SYXK（冀）2016-0047。饲养于温度20～23℃，湿度45%～60%，过氧乙酸溶液消毒环境，标准大鼠饲料和水喂养。

1.1.2 主要试剂与仪器 AG490（JAK2/STAT3通路阻断剂，批号：T3434，Santa Cruz Biotechnology，Inc.），孕三烯酮胶囊（2.5 mg，批号：53140701，华润紫竹药业有限公司），硫酸庆大霉素注射液（2 mL，8万单位，批号：1607201，山东华鲁制药有限 公 司），雌二醇片（2 mg，批 号 ：340436，Solvay Pharmaceuticals B.V.，雌二醇磨去糖衣后碾碎，用1%羧甲基纤维素钠溶液溶解），兔抗人JAK2（phospho Y1007+Y1008）多克隆抗体（ab32101，Abcam Ltd），兔抗人JAK2多克隆抗体（ab39636，Abcam Ltd），小鼠抗人STAT3（phospho Y705）单克隆抗体（SC-8059，Santa Cruz Biotechnology，Inc.），兔抗人STAT3单克隆抗体（ab68153，Abcam Ltd），兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体（ab181602，Abcam Ltd），HRP标记兔抗小鼠IgG二抗（ab6728，Abcam Ltd），HRP标记山羊抗兔 IgG 二抗（ab97051，Abcam Ltd）。电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂），凝胶成像系统（BIO-RAD PACIFIC Limited）。

1.2 方法

1.2.1 造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg体质量），麻醉后，剖开腹部找到子宫，将右侧子宫周围组织分离，用手术线将子宫的两头结扎，两结扎处之间相距大约1 cm，剪取。把切取的子宫内膜竖向剪开，在左侧腹部的腹壁上内膜向里用缝合针和手术线打结钉上，再缝合大鼠腹部。假手术组仅进行右侧子宫的结扎和剪取，不缝合于腹壁上，其余操作同上。手术后对每只大鼠进行腹腔注射硫酸庆大霉素注射液，用药量为0.4万U/只，连续注射5 d。进行手术的次日，为加快移植子宫内膜的生长，对每只大鼠灌胃雌二醇，假手术组则灌胃等量1%羧甲基纤维素钠溶液，用药量为10 mL/kg体质量，每5 d 1次，共3次。末次灌胃雌二醇4 d后，再次麻醉大鼠，开腹后观察子宫内膜组织移植部位，若肉眼可见内膜组织生长且内有液体积聚的透明小囊，则为造模成功。

1.2.2 分组及给药 将造模成功的40只大鼠按体质量分为4个区组，然后将每个体质量范围内的大鼠采用随机数字表分为2组，分别为模型组、JAK2/STAT3通路抑制剂组（AG组），每组20只，另设假手术组大鼠20只。AG组于造模前5 min腹腔注射AG490（1 mg/kg体质量），手术后按4 mg/kg体质量注射，每周2次，连续6周，模型组给予生理盐水。

1.2.3 取材 末次给药后禁食12 h，麻醉大鼠，剖开腹部，以游标卡尺测量异位子宫内膜的长径（a）和短径（b）后取材，假手术组剪取正常子宫组织，部分组织在10%福尔马林溶液中固定，剩余组织于-80℃冻存。

1.3 检测指标

1.3.1 异位内膜体积和生长抑制率 分别按照下列公式计算异位内膜体积和生长抑制率。异位内膜体积（V）=a×b2×0.52。抑制率=（模型组平均体积-AG组平均体积）/模型组平均体积×100%。

1.3.2 组织形态学分析 取异位子宫内膜组织或正常子宫组织，常规石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色（HE），光镜观察。

1.3.3 蛋白印迹法（Western blot）检测组织中蛋白表达 取大约500 mg异位内膜组织，加入1 mL裂解液匀浆，冰上静置消除泡沫后，4℃，12 000 r/min离心5 min，取上清液加入SDS Loading Buffer，沸水浴加热5 min变性。蛋白样品进行SDSPAGE电泳，每孔上样等量总蛋白。电泳结束后，将蛋白转到PVDF膜上，5%BSA封闭2 h。随后分别加入1∶2 000的p-JAK2、JAK2、P-STAT3和STAT3多克隆抗体，以GAPDH为内参，4℃冰箱过夜。次日加入1∶2 000的HRP标记二抗，室温孵育1 h，洗膜，经ECL化学发光检测并记录各目的条带及内参条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠异位内膜体积的差异以及生长抑制率 模型组大鼠子宫内膜移植物体积增大，呈半透明的囊状，囊内有液体积聚，表面有血管分布，盆腔有广泛粘连；AG组大鼠子宫内膜移植物体积较小，囊内仅有少量液体或无液体，盆腔粘连轻微，见图1。测量并计算各组大鼠异位内膜体积，模型组为（155.69±137.57）mm3，AG组为（53.46±49.96）mm3，较模型组体积显著减小（t=2.210，P＜0.05），异位内膜组织生长的抑制率为65.66%。

Fig.1 The appearance of rat endometrial graft图1 各组大鼠子宫内膜移植物外观

2.2 各组大鼠异位内膜组织病理形态学差异 假手术组子宫内膜被覆单层柱状上皮，排列整齐，肌层较厚；模型组异位子宫内膜被覆上皮细胞呈扁平状，腔体内有中性粒细胞聚集，血管较为丰富；AG组大鼠异位内膜表现出不同程度的变薄萎缩，上皮细胞缺失，见图2。

2.3 各组大鼠子宫内膜组织中JAK2、STAT3磷酸化水平比较 与假手术组相比，模型组大鼠异位内膜组织中JAK2、STAT3总蛋白及其磷酸化水平（p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3）均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，AG组大鼠异位内膜组织中STAT3总蛋白及其磷酸化水平均明显降低（P＜0.05），AG组大鼠异位内膜组织中JAK2磷酸化水平较模型组明显降低，但其总蛋白表达与模型组相比差异无统计学意义，见表1，图3。

Fig.2 Pictures showing pathological morphology of ectopic endometrium in three groups（HE staining，×100）图2 各组大鼠异位内膜组织的病理形态（HE染色，×100）

Tab.1 The protein expressions of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in the endometrium tissues of rats表1 各组大鼠内膜组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白表达 （n=3，±s）

Tab.1 The protein expressions of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in the endometrium tissues of rats表1 各组大鼠内膜组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白表达 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05

p-JAK2 0.25±0.02 0.63±0.03a 0.31±0.01ab 199.89＊＊组别假手术组模型组AG组F JAK2 0.42±0.07 0.65±0.05a 0.57±0.01a 17.43＊＊p-JAK2/JAK2 0.61±0.13 0.97±0.12a 0.55±0.03b 14.55＊＊p-STAT3 0.11±0.01 0.66±0.07a 0.33±0.02ab 131.90＊＊STAT3 0.52±0.01 0.86±0.07a 0.70±0.01ab 46.02＊＊p-STAT3/STAT3 0.21±0.01 0.77±0.02a 0.47±0.02ab 774.99＊＊

3 讨论

EMS是一种常见的妇科疾病，在育龄期妇女中多发。由本病引起的盆腔痛、痛经、不孕等问题，给患者的工作和生活带来极大的困扰。EMS虽为良性疾病，却具有迁移、侵袭、种植、复发等类似于肿瘤的恶性生物学特征［3-4］。多年来，国内外学者一直在努力探索EMS的发病机制，以利于这一疾病的治疗。1921年Sampson提出的“经血逆流”学说，被作为经典理论，该学说认为脱落的子宫内膜碎片流入腹腔，种植在盆腔脏器表层，并在雌、孕激素的作用下不断发展形成病灶［5］。而子宫内膜能否在“异域”生长以至发病，要经过黏附、侵袭和血管形成三个复杂的病理生理过程，涉及到细胞黏附因子、侵袭因子、血管生成因子，并与信号转导密切相关［6-7］。信号转导的关键点是转录因子，这些转录因子通过调控下游基因的表达，形成与子宫内膜细胞的迁移、侵袭等生物学行为相关基因启闭的“总阀门”。如果找到某些关键的转录因子靶点，就可以阻断下游基因，引发“级联式”阻断，抑制多种基因表达，进而达到抗异位内膜细胞生长的目的。

JAK/STAT信号通路，与细胞分化、增殖、侵袭、凋亡抵抗和免疫抑制均密切相关［1-2］。STAT3是STAT家族的重要成员，受JAK2的作用，形成信号转导通路，其过度表达与肿瘤的发展密切相关。病理状态下，大量干扰素、白细胞介素-6（IL-6）、生长因子等与细胞膜上相应的受体结合，可引起细胞内JAK2的聚集、相互作用，并发生磷酸化。活化后的JAK2与细胞质内的STAT3结合，引起STAT3磷酸化［8］。STAT3被激活后，进入核内，直接或间接调控相关基因诱导细胞增殖、分化，形成新生血管。

Fig.3 The protein expressions of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in the endometrium tissues of rats图3 各组大鼠子宫内膜组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白表达

为证实JAK2/STAT3信号通路在EMS发展过程中的作用，本研究采用自体移植法复制大鼠EMS模型，检测JAK2和STAT3总蛋白及其磷酸化水平，结果表明异位病灶部位JAK2和STAT3总蛋白及其磷酸化水平明显高于正常子宫组织。有研究证实，激活后的STAT3能以二聚体的形式持续进入核内，对血管内皮生长因子（VEGF）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶（MMPs）等下游靶基因进行调控，导致其高表达［9-10］。VEGF能促使血管异常增生，MMPs也可在新血管生成的初期加强原有血管的重构，Bcl-2使细胞抗凋亡能力增强［11-12］。三者的高表达促进了局部病灶血管的生成和细胞增殖、侵袭和迁移，有利于EMS的发生［10］。本研究以AG490干预后，通过对这一通路的抑制，JAK2和STAT3的磷酸化水平显著降低，模型大鼠表现出异位病灶体积明显减小，病理改变情况减轻。因此推测，JAK2/STAT3信号通路在EMS的发展过程中发挥了重要作用，而抑制JAK2/STAT3信号通路则能够对EMS的治疗产生积极作用，本研究为探讨EMS的发病机制提供了实验依据，也为EMS的治疗用药研发提供了新的思路。