王黎明，杨大业，仇剑，张德巍

（中国医科大学附属第四医院第三普通外科，沈阳 110032）

肺癌是病死率居世界首位的恶性肿瘤，主要分为小细胞肺癌 （约占15%） 和非小细胞肺癌 （约占80%） 两大类［1-3］。虽然目前外科手术及联合治疗有了很大的进展，但是其5年生存率仍然不高。

miRNA是长度在18～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有多种生物学功能，对恶性肿瘤的发生发展等过程有重大影响。与mRNA相比，miRNA代谢周期长，更适合作为肿瘤的标记物［4-5］。miR-24在多种肿瘤中存在异常表达的现象，在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等肿瘤中miR-24均被发现有不同程度的下调［6］，在宫颈癌Hela细胞中miR-24也被证明可以显著地抑制细胞生长、促进细胞凋亡［7-9］，但是在肺癌中鲜有报道。本研究拟探讨miR-24调节肺癌发生发展的机制，为肺癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌细胞系A549 （实验室冻存） ，DMEM培养基 （美国HyClone公司） ，胎牛血清 （天津灏洋生物有限公司） ，miR-24拟似物 （CATGAGGGCAGAAACCG ATGCAA） ，miR-24抑制物 （GTTGCATCGGTTTCTGC CCTCATG，广州锐博生物有限公司） ，台盼蓝 （上海碧云天生物有限公司） ，噻唑蓝 （thiazolyl blue，MTT） ，抗体：周期素依赖性激酶4 （cyclin dependent kinase 4，CDK4） ，周期素依赖性激酶6 （cyclin dependent kinase 4，CDK6） ，基质金属蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP2） 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（美国Santa公司） ，SYBR Green （美国Promega公司） 。

选取本院2010至2015年术前未接受过放化疗的肺癌患者30例，其中，＜45岁8例，≥45岁22例，平均年龄49.25岁 （42～67岁） 。取其肿瘤组织及癌旁组织，组织取下后置于液氮中备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：实验中所需的肺癌细胞系A549细胞为实验室冻存，在25 mL 培养瓶中培养，并加入适量含10%胎牛血清的无抗生素的DMEM培养液，于5%CO2、37 ℃的孵箱条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT实验：以1×104/孔的密度将A375细胞接种于96孔板中，12 h后分别转染miR-24 拟似物/抑制物。处理后分别在0 h、12 h、24 h、36 h和48 h加入MTT，孵育4 h后加入100 μ L DMSO溶解MTT-甲臜结晶，15 min后，测量490 nm吸光值。

1.2.3 Transwell实验：对数生长期细胞以1×105每孔的密度接种于Transwell小室中，终体积200 μ L，下室加入600 μ L无血清培养基，12 h后更换培养基，使用不同因素处理细胞，每组设3个复孔。转染24 h后，棉签擦去上层细胞，95%乙醇固定20 min，0.4 %台盼蓝染色20 min。200倍显微镜下观察。

1.2.4 Western blotting：不同因素处理细胞24 h后收集细胞，通过裂解得到蛋白。取等量蛋白进行SDSPAGE电泳。90～110 V电泳2 h、4 ℃下100 V转膜1 h，洗膜，5 %脱脂奶粉室温封闭1 h，对应一抗4 ℃晃动孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1 h，洗膜后ECL发光仪发光。

1.2.5 实时PCR：取适量 （50～100 mg） 组织样品粉碎组织，加入1 mL Trizol 试剂在室温下静置1～5 min。加入0.2 mL氯仿，振摇15 s，室温静置2～3 min。离心15 min （12 000g，2～8 ℃） 。吸取上层水相，取0.4～0.5 mL到新的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置5～10 min。离心10 min （12 000g，2～8 ℃）弃上清。加入75 %乙醇，振摇数次。离心5 min （7 500g，2～8 ℃），真空干燥后，用DEPC处理水30～40 μ L溶解沉淀，55 ～60 ℃孵育10～15 min。测OD值将得到的RNA反转录成cDNA，进行实时PCR反应。所用引物为miR-24，F：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACCTC-3’，R：5’-GGACT GTCTTGGCATCCATGTAG-3’；U6，F：5’-CTCGCTT CGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3’。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据的显著性比较使用成组设计t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-24与肺癌的相关性

检测30例肺癌组织及癌旁组织的miR-24含量，实时PCR结果发现，肺癌组织中miR-24的表达量下降约为47.64%，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。

生存分析发现，miR-24的表达情况与患者的预后密切相关，miR-24表达较低的患者中位生存期约为30个月，但是miR-24表达较高的患者的中位生存期可达到60个月，见图1。

2.2 miR-24对肺癌增殖的影响

在肺癌细胞系A549细胞中过表达miR-24或者将miR-24下调后，使用MTT的方法检测miR-24对A549细胞的增殖影响。结果发现，miR-24过表达后可以显著抑制A549细胞的增殖，反之，当miR-24下调后，A549细胞的增殖得到促进，见表1。

2.3 miR-24对肺癌迁移的影响

在肺癌细胞系A549细胞中过表达miR-24或者将miR-24下调后，使用Transwell的方法检测miR-24对A549细胞的迁移影响。结果发现，miR-24过表达后可以显著抑制A549细胞的迁移，反之，当miR-24下调后，A549细胞的迁移受到促进，见图2。

图1 miR-24与肺癌患者预后的关系Fig.1 Relationship between overall survival and miR-24 expression in lung cancer patients

2.4 miR-24对肺癌细胞中相关蛋白的影响

在A549细胞中分别将miR-24过表达或者抑制miR-24表达24 h后，通过Western blotting实验检测发现，miR-24过表达可以显著抑制A549细胞中CDK4/6和MMP2的表达，反之，当miR-24受到抑制后CDK4/6和MMP2的表达有所上升，见图3。

表1 miR-24对A549细胞增殖的影响 （，n = 3）Tab.1 Effect of miR-24 on the proliferation of A549 cells （，n = 3）

1） P ＜ 0.05 compared with control group.

Control 0.27±0.02 0.44±0.02 0.67±0.02 0.84±0.03 0.96±0.01 miR-24 mimic 0.24±0.03 0.34±0.021） 0.47±0.021） 0.54±0.021） 0.65±0.011）miR-24 inhibitor 0.22±0.02 0.55±0.021） 0.75±0.011） 0.96±0.021） 1.06±0.021）

图2 miR-24对A549细胞迁移的影响 ×200Fig.2 Effect of miR-24 on the migration of A549 cells ×200

3 讨论

miRNA具有组织特异性，目前研究［10］报道指出，let-7c、miR-34、miR-21、miR-143等多种miRNA均在肺癌中存在异常表达的现象。这些miRNAs在肺癌组织中表达降低或者升高，以发挥癌基因或者抑癌基因的作用、通过调节转录后翻译，促进或者抑制肺癌的发生发展。

miR-24广泛存在于哺乳动物的多种组织中，在多种肿瘤中存在异常表达的现象［11］。有研究［12-14］表明，miR-24在宫颈癌Hela细胞中具有抑制细胞生长和促进细胞凋亡的作用；在人类纤维肉瘤中，miR-24可以增强细胞对甲氨蝶呤的敏感性；miR-24在卡波西肉瘤中异常表达，可以作为其特异性生物标记物；miR-24可以通过抑制二氢叶酸还原酶的表达来实现抑制肿瘤细胞增殖的作用；在K562等细胞系中，miR-24被证明可以通过抑制E2F2和MYC来调节细胞的增殖和侵袭转移；在乳腺癌细胞系中，miR-24被证明可以增加肿瘤细胞对DNA损伤药物的敏感性；miR-24与抗癌药物联合应用后也可以降低化疗药物的使用剂量。

图3 Western blotting检测miR-24对A549细胞中CDK4/6和MMP2蛋白水平的影响Fig.3 Expression of CDK4/6 and MMP2 in A549 cells after treatment with miR-24 mimic/inhibitor detected by Western blotting

本研究对30例肺癌患者组织中miR-24的表达情况进行分析，发现miR-24在肺癌组织中的表达普遍较低。miR-24的表达情况与患者预后密切相关，本研究结果提示，miR-24表达较高的患者的预后较好。在A549细胞中分别将miR-24过表达或者抑制表达后，通过MTT实验检测了细胞的增殖情况，结果指出，miR-24可以显著抑制A549细胞的增殖。利用Transwell实验检测了细胞的迁移能力，结果证明，miR-24对肺癌细胞的迁移能力有很强的抑制作用。接下来通过对细胞周期相关蛋白CDK4/6和侵袭转移相关蛋白MMP2的检测发现，miR-24可以下调这些蛋白的表达，由此可见，miR-24可以通过调节CDK4/6和 MMP2蛋白的表达来抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力，进而实现对肺癌的调节作用。

本研究结果显示，miR-24可以抑制肺癌细胞的增殖和迁移，这为肺癌的治疗提供了新的方向。