韩耕宇，李华福，许 宸，谢 群

(1珠海市人民医院泌尿外科,广东 珠海519000；2中山大学附属第七医院,广东 深圳518102)

0 引言

膀胱癌作为全球第九大恶性肿瘤,每年有超过430 000新发人群［1］。在欧洲,同年发生的膀胱癌新发人群有118 000,每年死亡人数达到 52 000［2］。而在美国,每年有超过70 980新发人群,每年死亡人数达到14 330［3］。75%的初发膀胱癌中有75%的患者为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC),主要治疗手段包括经尿道电切术(transuretheral resection,TUR)和膀胱灌注治疗；还有25%的初发膀胱癌患者为非肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),主要治疗手段为膀胱癌根治术(radical cystectomy,RC)［4］。 NMIBC容易复发和进展,而MIBC则更容易发生转移从而影响预后。MIBC行RC后其肿瘤特异死亡率仍为50%～70%［5］。 NMIBC 5年复发率为 30%～80%,进展率为1%～45%［6］。虽然肿瘤的分级、分期对膀胱癌的治疗与预后评估起重要作用,但这些指标尚不能完全反映该肿瘤的生物学特性。不同侵袭性膀胱癌患者的生物学特征存在差异,这些差异可能是由不同基因的表达以及突变所引起。膀胱癌是一种多基因相关肿瘤,在机体内在因素与外在因素的联合作用下导致了膀胱癌的发生,是由细胞中基因的改变并积累而逐步形成的,细胞的癌变是一个十分复杂的过程［7］。分子生物学层面,膀胱癌变机制主要涉及癌基因激活及过度表达、抑癌基因突变及缺失、修复功能相关基因的功能丧失、在基因组中出现了核苷酸异常的串联重复,微卫星不稳定、调控信号传导通路的功能紊乱、细胞端粒酶过度表达、细胞凋亡机制发生障碍以及出现浸润转移等相关分子事件［8］。而出现浸润转移等相关分子事件可能与不同侵袭性膀胱癌相关,一些研究也发现某些基因在NMIBC中发生基因丢失的概率明显低于浸润性膀胱癌,故认为膀胱肿瘤的侵袭性可能与这些有着密切关系［9］。

探讨不同侵袭性膀胱癌患者基因差异表达,能够为我们明确两者的生物学特征,对靶向治疗以及诊断具有重要的意义。因此本研究通过比较不同侵袭性膀胱癌患者的组织肿瘤细胞预后和基因表达谱,筛选与不同侵袭性膀胱癌患者相关的差异表达基因,并分析其涉及的关键通路,为寻找更准确、简便、实用的生物标记,鉴别诊断和指导个体化治疗提供新思路。

1 材料和方法

基因表达谱数据来源于基因表达综合数据库(GEO,Gene Expression Omnibus,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)［10］。 材料为膀胱癌组织,分离单个肿瘤细胞。采用Illumina公司出品的Illumina human-6 v2.0 expression beadchip生物芯片。GEO登陆号为 GSE13507［11］。 由 Seon-Kyu Kim 等提交,包括103例NMIBC患者,62例MIBC患者标本。

采用GEO数据库的GEO2R在线分析工具进行差异表达基因分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)。该工具基于R程序语言,利用R语言中GEOquery和limma程序包,应用t检验筛选差异表达基因［12］。基因表达谱数据具有高维度(检测的基因数非常多,通常几千甚至上万)和小样本量的特点,需要多重假设检验(Multiple test)控制。本研究中多重假设检验控制采用 Benjamini和Hochberg提出的假阳性率控制法［13］。差异基因筛选标准：P＜0.05,校正P值(adjustedP-value)＜0.05,基因表达值倍数变化(fold change,FC)≥1.5。最后通过信噪比(scalable profile,SNP)的差异进行排序,用 pearson相关分析生成聚类分析热图,并用R语言进行热图绘制。

利用UniHI数据库(Unified Human Interactome database,http：//www.unihi.org/)找出与之能发生相互作用的蛋白质［14］。分析其所编码的蛋白之间的相互作用,然后在线作图,删除与其它蛋白无相互作用的节点后,调整图中节点位置以充分暴露其互作网络形态,绘制差异基因互作网络图。

GEO数据库膀胱癌患者的随访资料提供下载MINiML formatted family file(s)数据,并使用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用Kaplan-Meier法计算总体生存率(overall survival,OS)和肿瘤特异死亡率(cancer specific mortality,csm),Log-Rank法比较OS的差异。不同分组的频率分布和临床病理特点采用Pearson's chisquare检验。患者的一般情况见表1。

表1 NMIBC患者与MIBC患者一般情况

2 结果

NMIBC 患者1、3、5年 OS分别为90.3%、81.5%、72.19%；MIBC患者 1、3、5年 OS分别为 82.7%、49.1%、38.3%。两组患者OS比较,差异有统计学意义(P＜0.001),NMIBC的OS优于MIBC患者(图1)。NMIBC患者 1、3、5年 CSM 分别为 97.9%、96.3%、95.4%；MIBC 患者 1、3、5年 OS分别为 85.8%、55.7%、43.4%。两组患者CSM差异有统计学意义(P＜0.001),NMIBC的CSM优于MIBC患者(图2)。

图1 NMIBC与MIBC OS对比

图2 NMIBC与MIBC CSM对比

NMIBC对比MIBC患者基因差异表达中上调有17个,下调基因 8个(图 3)。下调的基因包括S100A8、ACTG2、CALD1、FLNC、ATF3、MT2A、SLC2A3以及CTGF。上调的基因包括 ST3GAL5、CRTAC1、TESC、TMPRSS4、D4S234E、BTBD16、C10ORF99、CTSE、 LOC644844、 SPOCD1、 ANXA10、 SLC14A1、HSD17B2、KRT13、SYT8、FABP4 以及 HS.580308。

图3 NMIBC对比MIBC患者基因差异表达热图

NMIBC对比MIBC差异表达基因中上调有17个基因构建蛋白质相互作用网络,除去孤立无互作的蛋白节点,筛选出4个上调基因编码的蛋白质具有相互作用关系,基因圆圈大小代表该基因的影响分数,作用的大小以Interaction大小表示由图4可知ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3发挥重要的作用。NMIBC对比MIBC差异表达基因中下调有8个基因构建蛋白质相互作用网络,除去孤立无互作的蛋白节点,筛选出2个下调基因编码的蛋白质具有相互作用关系,基因圆圈大小代表该基因的影响分数,作用的大小以Interaction大小表示,由图5可知HSD17B2基因和FABP4基因发挥重要的作用。

图4 上调基因编码的蛋白质相互作用图

图5 下调基因编码的蛋白质相互作用图

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其中肌层浸润型膀胱癌易远处转移,预后较差。多种复杂分子机制参与膀胱癌的侵袭、转移过程。肿瘤侵袭是各种肿瘤发展的重要过程,在膀胱移行细胞癌,癌细胞侵入肌层、血管或膀胱周围组织的情况与膀胱癌的局部复发、转移和预后密切相关。一些蛋白质可通过调控肿瘤细胞的生长、迁移、黏附、凋亡或肿瘤免疫等途径影响肿瘤细胞的恶性程度、侵袭和转移能力。所以,通过比较不同恶性程度的膀胱癌细胞系之间蛋白质组的差异,可以发现一些与膀胱癌恶性程度相关的特异性蛋白质,深入了解这些蛋白质的功能,将有利于促进膀胱肿瘤诊断和治疗的研究以及新药物的开发。本研究利用基因表达综合数据库(GEO)获得包括 103例NMIBC患者和62例MIBC患者标本,进行差异表达基因分析、生存预后分析以及GSEA基因富集分析,发现NMIBC的CSM优于MIBC患者,筛选出4个上调基因(ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3)编码的蛋白质具有相互作用关系,筛选出2个下调基因(HSD17B2基因和FABP4基因)编码的蛋白质具有相互作用关系。

早期发现膀胱癌的侵袭性是临床的一大挑战,大量的基于基因方面的研究希望能够发现能够早期预测膀胱癌侵袭性的基因或者标志物,但是都存在一定的局限性［15］。本研究发现 NMIBC对比 MIBC差异表达基因中上调的基因中,ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3具有重要意义；下调的基因中,HSD17B2基因和FABP4基因具有重要意义。

ATF3基因(转录激活因子3)在正常静息的细胞中表现为稳态表达,mRNA的基础水平非常低,在体外培养的细胞中,ATF3基因可被细胞因子、生长刺激因子、病毒蛋白和信号分子诱导表达［16］。一些研究表明,ATF3基因在转录调控、细胞凋亡和细胞周期进展中扮演重要角色,在多种肿瘤中呈高表达,促进肿瘤的发生发展、侵袭转移,但其中的机制并不清楚［17］。 臧盛兵［18］等通过研究结直肠癌组织 ATF3基因表达的临床意义分析时发现,ATF3基因表达与结直肠癌的发生密切相关,ATF3基因可能通过调控CyclinD1表达而促进结直肠癌的发生发展及侵袭转移。但是ATF3基因在膀胱癌的作用可能会得出不一样的结果。上海交通大学医学院附属新华医院检验科沈立松教授领衔的科研团队在膀胱癌侵袭转移的机制研究中发现A TF3是一种新的膀胱癌转移抑制基因,并阐明了A TF3通过调控凝溶胶蛋白(gelsolin)介导的细胞骨架蛋白重构抑制膀胱癌细胞转移的新机制［19］。本研究也发现了NMIBC中ATF3基因表达上调,说明ATF3基因的重要作用。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)的下游介质,具有明显的有丝分裂原性和趋化性［20］。CTGF表达水平在纤维化组织中表达上调并且促进其发展,并且与伤口的愈合、肿瘤发生、进展、转移及预后密切相关［21］。陈幕华等［22］通过研究甲状腺组织CTGF基因的表达及其临床意义发现CTGF在甲状腺癌组织的高表达可能是肿瘤发生过程中的一个重要因素。但是该基因在膀胱癌中的作用尚未得到足够的研究,其中对于NMIBC基因的上调,需要未来更多的研究去证实。金属硫蛋白(MT)是一类普遍存在于各种生物的富含半胱氨酸的小分子蛋白,其主要功能是重金属离子解毒,调控金属离子代谢、抗氧化。大量的研究发现它还具有调节细胞繁殖周期的作用,与肿瘤的发生、转移有关［23］。 Kim 等［24］研究表明,MT-2A 过表达可以增强乳腺癌细胞的转移能力,其调控机制是通过激活AP-1和 NF-κB因子进而上调MMP-9蛋白实现的。MT-2A基因在膀胱癌中的作用尚未清晰,仍需更多的研究去支持。葡萄糖转运蛋白3编码基因 SLC2A3是SLC2A基因家族的一员,SLC2A3在多种类型癌症细胞中均高表达,如间充质状态的非小细胞肺癌和胶质细胞瘤、喉鳞状癌、低分化的子宫内膜癌和乳腺癌中等［25］。高表达的SLC2A3与口腔癌的侵袭、大小、病理分期以及复发呈显著正相关［26］。但SLC2A3基因在膀胱癌的相关研究尚需进一步验证。

17β-羟甾类固醇脱氢酶(17-beta dehydrogenase1,HSD17B)属于雌激素代谢酶,它参与调节组织中雄激素和雌激素水平。HSD17B2是NADPH依赖的氧化酶,它能催化高活性的17B-羟类固醇与低活性酮类固醇之间的转换［27］。HSD17B2是雌二醇的失活转变为雌激素酮的主要因素。HSD17B2同工酶可抑制肝脏、胎盘和子宫内膜中的性类固醇激素。有研究表明接近80%的膀胱尿路上皮癌患者的癌组织中,都可以检测到表达雌激素受体,表达的升高与膀胱癌的不良预后紧密相关［28］。 吴育栋等［29］通过探究雌激素及其受体抑制BCG疗效的机制与浅表性膀胱癌复发的关系发现雌二醇可以抑制BCG与肿瘤细胞的粘附及进入细胞从而降低BCG的疗效。说明HSD17B2基因表达的下调可能是导致NMIBC预后较好的一个重要因素。脂肪酸结合蛋白(Fatty acidbinding proteins,FABPs)家族是一类参与脂类的运输、代谢和细胞内信号传导的细胞内蛋白质［30］。相关研究发现,FABP4可能参与了脂肪组织对多种腹腔肿瘤的转移促进作用,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、黑色素瘤等,机制可能为其参与脂肪为肿瘤供能或对一些相关靶基因的表达调控［31］。Andersen等［32］发现FABP4基因的表达与膀胱癌的进展有关。本研究发现NMIBC基因下调,说明该基因对膀胱癌的侵袭性有一定的作用。

综上所述,本研究利用GEO数据集,结合生物信息学分析方法,初步表明了ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3在NMIBC样本中的表达比在MIBC更高；可能是因为ATF3基因通过调控凝溶胶蛋白(Gelsolin)介导的细胞骨架蛋白重构抑制膀胱癌细胞转移,这可能也是NMIBC患者预后明显高于MIBC的原因。但是CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3基因在其他一些肿瘤中的表达往往与预后相关,与本研究得出的结果有差异,其中的原理尚需我们进一步验证。HSD17B2基因和FABP4基因在MIBC样本中的表达比在NMIBC中更高,HSD17B2基因的上调可以使雌激素受体激活,从而降低膀胱癌对于灌注化疗的敏感性,这可能是影响其预后的重要因素。而FABP4基因的过度表达与肿瘤的侵袭性有重要关系,这也是其中的一个重要原因。本研究只是从生物信息学的角度进行分析,可能存在一定的偏差,其中的一些机制以及基因表达的研究需要更多的实验继续去验证。