姜 超，王 婷，徐中菊

(1西安医学院第二附属医院神经内科,陕西 西安710038；2上海中医药大学附属龙华医院,上海200032；3西安医学院第二附属医院信息科,陕西 西安710038；4上海浦南医院,上海200125)

0 引言

目前,关于miRNA与免疫系统相关性的研究报道日益引起人们的重视,相对于临床上容易获得的血清样本,我们有理由相信,对获得与免疫系统疾病发病、进展或临床治疗紧密关联的血清miRNA进行深入地相关研究无疑是目前很好的思路。迄今为止,关于miRNA和重症肌无力(myasthenia gravis,MG)之间可能的关系鲜有报道。已知MG是一种典型的依赖T细胞且B细胞介导的自身免疫性疾病,虽然对于其发病机制的探索一直从未停止,但和其他的自身免疫性疾病一样,对于触发其发病的源头依然不是很清楚。在中医上,对MG尚无完备记载,但从其病机和临床表现分析,当属虚损之“痿证”范畴,结合我们前期研究发现,其病位可主要定于脾肾［1－2］。那么,基于病症结合的理论指导去深入分析脾肾亏虚型(spleen and kidney deficiency type,SKDT)MG血清miRNA表达的相关研究对于未来探索新的治疗MG的方法很有意义,值得进一步深入研究。

1 资料和方法

1.1 临床病例来源研究的34例MG患者来源于2010年11月至2012年4月上海中医药大学附属龙华医院以及辽宁中医药大学附属医院门诊,全部符合本研究纳入标准。患者年龄为14～75岁。受试者被告知,自愿签署知情同意书。西医诊断标准：符合MG基本诊断标准［3］,包括重复刺激神经肌肉传递障碍的肌电图模式的波动性,肌无力症状支持,为改良OssemanⅠ型,ⅡA型、ⅡB型。中医诊断标准：符合中医痿证基本诊断标准［4］。凡具备主证1项和次证1项以上,或兼见舌苔脉象即可。排除标准如下：①Osseman方案Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型者。②家族性MG,先天性MG综合证及药物(青霉胺、α-干扰素等)所致MG。③妊娠或哺乳期妇女。④有合并证的疾病,如脑血管疾病、肾功能不全、造血系统疾病、精神疾病的患者。⑤过敏体质(对2种以上食物或药物过敏者)。⑥近1个月内参加过其他药物临床试验。⑦近3个月内曾静脉应用丙种球蛋白或行血浆置换治疗的患者。按照排除标准进行排除。本研究由龙华医院的伦理审查委员会批准,并获得所有参与研究的书面许可。

1.2 血清样本的收集和处理①对每名研究对象采用非抗凝真空采血管空腹采集血液样品6 mL；②血样采集完毕后,尽快(1 h内)室温下普通离心机3500 rpm/min,离心5 min；③可见上层血清,将上层血清小心取出,分装至灭菌冻存管中并标记,置于－80℃冰箱中储存备用。④进行样本简要信息记录,包括样本编号、研究对象一般资料,病史材料、CRF表填写。

1.3 总miRNA的提取及纯化采用TRIzol Reagent和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit对血清miRNA进行提取、分离。抽提过程参照试剂盒(mirVana RNA Isolation Kit-Applied Biosystem p/n AM1560)说明规范进行。

1.4 芯片检测miRNA干冰运输送到上海豪伯生物技术有限公司进行Agilent人类miRNA array杂交(v.12.0)。每个芯片杂交标记Cy3或Cy5的单个样品。按照背景减法和规范进行。miRNA芯片质量控制标准：2100 RIN＞＝6.0且28S/18S＞＝0.7,通过后才可以进行下一阶段研究。

1.5 数据收集处理和统计学方法分析实验结果运用使用2－ΔΔCT法测定了各组细胞中miRNA的相对表达水平。

计算公式：ΔCt＝检测基因 Ct值的平均值－管家基因(U6 snRNA)Ct值得平均值。ΔΔCt＝待测组ΔCt－对照组 ΔCt。 因此待测基因的表达量由 2－ΔΔCt来进行计算。结果表示miRNA在MG患者于正常人表达倍数。

1.6 统计分析临床样本统计分析使用Mann-Whitney检验,以评估不同分组之间的统计学意义。每个实验数据表示为±s。统计分使用Graphpad 5.0软件绘图,P＜0.05表示差异无统计学意义。数据均平行3次取平均值。

2 结果

2.1 入组患者的一般资料比较SKDT-MG患者中女18例,男16例,年龄17～75岁,平均48.70岁；正常人群中女5例,男5例,年龄20～70岁,平均46.5岁。两组人群年龄、性别构成比均衡,具有可比性(P＞0.05,表 1)。

表1 入组病例性别、年龄分布组间比较(例)

2.2 总RNA的纯度分析和质量检测Agilent miRNA芯片质控标准：RIN＞＝6.0且28S/18S＞0.7。抽提的RNA质量符合质控要求,可进行芯片杂交实验(表2)。

表2 抽提的RNA质量合格样本

2.3 MG组较正常组差异表达的miRNA筛选由于芯片检测过程中,每组仅有3张芯片,重复随机样本数量较少难以达到标准正态分布。为了减少小样本造成的差异筛选误,利用随机方差模型(random variance model,RVM)修正的F检验计算差异,检验计算差异miRNA间差异的显著性水平(P-value)和误判率(FDR),从而得到差异miRNA。治疗前,使用RVM对MG组和正常人组的差异性miRNA进行分析发现,总共筛选到43个差异性miRNA(差异倍数大于2倍),其中MG组较正常人组上调的miRNA有21个(表3),下调的miRNA有22个(表4)。采用Cluster 3.0和TreeView programs对差异表达的数据进行聚类分析,并制作热图(图1)。

表3 MG组较正常组表达上调的miRNA

表4 MG组较正常组表达下调的miRNA

图1 MG组较正常组差异表达miRNA聚类分析热图

3 讨论

MG是一种抗体介导,神经肌肉接头传递的慢性疾病,发病率为每年8/10万～20/10万人,其靶点是突触后蛋白,主要涉及骨骼肌乙酰胆碱胆碱受体(AchR)和特定肌肉的酪氨酸激酶［5－6］。 研究［6］认为,遗传因素在MG发病中发挥了重要作用。此外,病毒或细菌感染,如脊髓灰质炎病毒和大肠杆菌,也可能参与了MG的发病［7－8］。然而,目前还没有任何报告可以非常清楚地阐明其基本发病机制,现存的仅是一些公认的假说,MG复杂疾病的发病机制,已经严重阻碍了我们对疾病发生发展的理解,从而延缓了对易感个体的识别和治疗。该病的主要临床特征是骨骼肌无力症状的波动性。目前,抗胆碱酯酶药、非特异性的免疫抑制剂、胸腺切除术和血浆置换仍然是治疗MG的主要方法［9－11］。不幸的是,上面所言及的治疗措施具有一些严重的副作用,如心律失常、骨质疏松症和低血压,并不能抑制患者症状的复发,而达到完全缓解［12］。显然,有必要去更深入地探讨MG发病机制,寻求具有较高疗效和较少副作用的替代治疗MG的措施,这无疑成为研究的一个热点。中国传统医药(Traditional Chinese Medicine,TCM)由于其长期的疗效性以及较少的副作用,已经被用来治疗许多疾病,包括癌症、心血管疾病、炎症和 MG 疾病［13－17］。

MicroRNAs(miRNA)(19～22个核苷酸长)是一种小非编码RNA,其介导靶基因的转录沉默。在动物中,miRNA通常在靶基因3′非翻译区(UTR)的互补位点结合,并调节靶基因的表达,无论是翻译抑制,mRNAs的降解,或者两者全部［18］。自从 miRNA的发现,学者们就一直致力于确定miRNA及其相关的疾病生物学功能。miRNA的失调一直伴随着人类的某些疾病,如白血病和心脏疾病［19－20］。 在肿瘤发生及转移中,miRNA作为一个重要因素的出现,他们的表达特征与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌的预后和进展相关［21－22］。

生物信息学是最近兴起的一门将生物学、医学、信息学等学科交叉衔接起来的学科,目的是通过信息学的技术手段解决生命科学问题。生物信息学以其快速、方便、准确、灵活的特点正在生－命科学研究中发挥着重要作用。在miRNA研究领域也不例外,从miRNA研究的最开始到现在,生物信息学都发挥着至关重要的作用,生物信息学在miRNA识别、miRNA靶基因预测、miRNA功能分析、miRNA关联疾病分析、miRNA上游转录调控分析,SNP分析以及miRNA-药物相互作用分析等领域发挥着不可替代的作用,并得到越来越多的应用。

本研究采用了Agilen公司的miRNAs芯片产品,其具有特殊的芯片生产工艺,所以实验检测的灵敏度得到了极大的提高,且简化了操作步骤。同时不需要将总RNA纯化或者浓缩就可特异性检测出成熟的miRNA,这样就会大大避免浓缩或纯化总RNA的过程中造成miRNA损失带来的检测误差。因为芯片杂交数据的可靠性会受到芯片探针数目、样品质量、检测灵敏度等因素的影响,所以我们在数据分析前首先对原始数据进行筛选。且芯片杂交的荧光信号值需达到一定值才可认定其探针杂交信号有效,即芯片信号在扫描后会去掉假阳性或假阴性信号,从而提高芯片检测结果的准确性。同时为了消除不同芯片所带来的系统误差,会将样品检测结果的所有原始数据都进行中位数分析,再进行数据分析。最后,只有检测出有效信号值的miRNA才能进入下一步分析。因为芯片技术具有高通量的特点,所以会产生巨大的数据信息。高水平的数据分析不仅可以为我们找到一些重要的发现,同时还能发掘出更多的生物学信息,为我们的进一步研究提供准确的信息。所以对于高通量实验设计特别是芯片检测实验,数据分析决定了芯片实验的成功与否。在本试验中,我们判断两个样本校正后数据是否存在差异,主要是通过差异倍数和P值,只有当P＜0.05且差异倍数大于2时,我们才认定其差异有统计学意义,对于无法进行生物学统计的数据,我们则采取差异倍数大于2的标准,这些都是符合了一般数据处理标准。然而,由于存在仪器检测灵敏度、效率以及样本质量等因素,那么对于设定严格标准去筛选miRNA,仍需要大样本进一步研究验证后才能真正确定其客观的科学性和准确性。

本试验运用miRNA芯片技术对正常人和MG患者的血21条,显著表达下调的有22条。采用Cluster3.0和TreeView programs对差异表达的数据进行聚类分析。根据已筛选出的差异miRNA,进一步筛选出MG组的miRNA表达差异。并结合中医传统理论分型,初步证明SKDT-MG患者血清存在着确切的差异性miRNA表达谱,参考国内外最新的文献报道,依据筛选的血清miRNA表达量的高低,进一步选择特异性的血清miRNA予以验证。那么,基于外周血清miRNA的差异性表达以及中医药传统理论对于疾病分型,进一步探索SKDT-MG的发病机制,研究通过血清miRNA信号途径干预SKDT-MG的临床作用机制,尽早地对MG进行有效诊断干预,无疑具有重要的临床和科研意义。