叶广彬，陈源红，王长丽，曹德民，李根亮

（右江民族医学院，广西百色533000）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（ex－ opolysaccharide，EPS）是LAB在生长代谢过程中分泌的一种结构复杂的糖类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、增稠、絮凝及免疫调节等多种功能特性，广泛应用在食品、医药和化妆品等行业[1-2]。根据单糖组成不同，LAB EPS可分为同源多糖（homopolysaccharides，HoPS） 和异源多糖 （heteropolysaccharides，HePS）[3]。LAB HoPS根据糖单元内的连接方式和单糖成分不同，分为 4 类：（1）α-D-葡聚糖，单糖组成为葡萄糖，由α-1，6 糖苷键连接聚合，同时可能在 α-1，2、α-1，3 或α-1，4 位有分支结构；（2）β-D-葡聚糖，单糖组成为葡萄糖，糖单元以 β-1，2 键或 β-1，3 键连接；（3）β-D-果聚糖，单糖组成为果糖，以β-2，1键连接，可能在β-2，6处有分支结构；（4）其他，例如聚半乳糖，由结构一致的糖单元以不同的糖苷键连接聚合而成[4-5]。

能够产生EPS的LAB很多，大多分离于传统的发酵食品，如奶制品、黄豆酱、马奶酒、酸菜等。主要包括肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillus.plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lb.acidophilus）、开菲尔乳杆菌（Lb.kefiranofaciens）、鼠李糖乳杆菌（Lb.rhamnosus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、瑞士乳杆菌（Lb.helveticus）和食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）等[6-11]。随着LAB研究的不断深入，其作为食品级工业生产菌，与其他微生物相比安全性高。然而LAB EPS产量低，菌株稳定性差，是制约其大规模生产的主要因素[12]。此外，由于LAB的种类及来源不同，其产生的EPS的结构和特性均有所差异。为了满足食品、医药等领域的需要，筛选具有产量高、益生作用强的LAB是目前多糖产业发展的主要方向。

本研究从东北酸菜发酵液中分离得到一株高产EPS的菌株，利用生理生化试验、形态学观察及16S rDNA序列分析，鉴定其种属地位。并利用生物化学手段分离纯化EPS，探究其抗氧化性质，为该EPS的分离纯化奠定基础，为益生元特性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

酸菜发酵液：收集自哈尔滨农家自制酸菜。细菌基因组DNA提取试剂盒（M2023）、质粒小量提取试剂盒（M1603）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（L9014）：TIANGAN股份有限公司。

1.2 培养基

MRS 培养基（100 mL）：葡萄糖 2 g、胰蛋白胨 1 g、牛肉膏1 g，酵母提取物0.5 g，K2HPO40.2 g，无水乙酸钠0.5 g，柠檬酸铵 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.058 g，MnSO4·H2O 0.025 g吐温-80 0.1 mL，用于供试菌活化及种子液制备；产糖培养基（MRS-S）：用蔗糖代替MRS培养基中的葡萄糖。

1.3 仪器设备

SM20利用体视镜：长沙市秋龙仪器设备有限公司；BX43生物显微镜：奥林巴斯（深圳）工业有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计：日本岛津公司；vario ELⅢ元素分析仪：德国Elementar公司。

1.4 方法

1.4.1 产EPS LAB的分离

取酸菜发酵液样品，根据稀释倒平板法[2]将稀释液分别涂布于含CaCO3的MRS平板上，30℃倒置培养48 h。挑取单个具有典型溶钙圈菌落接种于30 mL/100 mL MRS-S产糖培养中，30℃，静置培养36 h，测定EPS含量，筛选得到高EPS LAB。

1.4.2 高产EPS LAB的鉴定

观察高产EPS菌株的菌落形态特征和菌体形态特征。根据蔡妙英常见细菌系统鉴定手册[13]分类鉴定及试验方法测定高产胞外多糖菌株的生理生化特性，包括葡萄糖产酸产气试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、明胶液化试验、脲酶及酯酶试验、精氨酸水解试验、淀粉水解试验以及糖发酵试验。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高产胞外多糖菌株基因组DNA，以P1：5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'；P2：5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'为引物[14]，按照Du等[2]方法进行16S rDNA部分序列扩增。PCR产物经1.0%琼脂凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒回收目的片段并进行测序。

1.4.3 EPS的提取及纯化

根据Du等[15]的方法，取发酵液 300mL，4℃4000×g离心40 min。上清液中加入3倍体积预冷的95%乙醇，沉淀过夜，4℃12 000×g离心40 min收集沉淀，用250 mL超纯水30℃～40℃溶解多糖沉淀，加入250 mL 10%三氯乙酸，充分搅拌4℃静置10 h，4℃12 000×g离心40 min，向上清液中加入3倍体积预冷的95%乙醇，沉淀过夜，4℃12 000×g离心40 min收集多糖沉淀，重溶于超纯水中，装入透析袋（截留分子量14 000 Da）中，4℃透析2 d，每8 h时换一次水。将透析得到的EPS样品，利用Sephadex G-100凝胶过滤层析进一步纯化。上样后，用流速为1 mL/min的去离子水在室温下进行洗脱，每5 min收集一管，用苯酚-硫酸法测定糖含量，合并含有糖的试管，冷冻干燥处理24 h得到EPS纯品。

将上述得到的纯多糖配制成1 mg/mL的多糖溶液，利用紫外可见分光光度计进行波长扫描，扫描范围为190 nm～350 nm，检测多糖样品的纯度。

1.4.4 元素组成分析

利用元素分析仪测定纯多糖样品中碳元素、氢元素、氮元素及硫元素含量。根据样品量、热导检测器信号和标准曲线，计算样品中的元素含量。

1.4.5 总糖、蛋白质、糖醛酸含量的测定

利用苯酚硫酸法测定总糖含量[16]；利用Bradford蛋白质染料结合法测定蛋白质含量[17]；利用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量[18]。

1.4.6 抗氧化活性测定

1.4.6.1 总还原力测定

取不同浓度的多糖溶液1 mL与2.5 mL铁氰化钾溶液、2.5 mL磷酸盐缓冲液，50℃反应20 min，之后加入 2.5 mL三氯乙酸（trichloroethanoic acid，TCA）溶液，4 000×g离心30 min。取2.5 mL上清液与0.5 mL FeCl3溶液、2.5 mL去离子水混匀，反应10 min后，测定反应体系的OD700nm值。以VC为阳性对照[19]。

1.4.6.2 DPPH·清除能力测定

取不同浓度的多糖溶液2 mL与2 mL DPPH-乙醇溶液混匀，暗反应30 min，测定混合液的吸光值OD517nm。以VC为阳性对照[20]。根据公式1计算样品的DPPH·清除活性：

式中：A0为以水为对照的吸光值；A1为与DPPH·反应后的吸光值；A2为样品溶液的吸光值，即以水代替DPPH溶液，排除样品本身吸光度对结果的影响。

1.4.6.3 羟基自由基（·OH）清除能力测定

1 mL不同浓度多糖溶液与1 mL水杨酸-乙醇溶液、1 mL FeSO4溶液混匀，再加入1 mL H2O2溶液，37℃反应40 min后，测定OD510nm值。以VC为阳性对照[21]。根据公式2计算样品的羟基自由基清除能力：

式中：A0为以水为对照的吸光值；A1为与·OH反应后的吸光值；A2为以水代替H2O2溶液的吸光值。

1.4.6.4 超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力测定

1 mL不同浓度多糖溶液与3 mL Tris-HCl缓冲液混匀，25℃放置20 min，之后加入0.3 mL邻苯三酚溶液混匀，25℃反应5 min后，加入1 mL浓盐酸，测定OD325nm值。VC为阳性对照[22]。根据公式3计算样品的O2-·清除率：

式中：A0为加入邻苯三酚后的吸光值；A1为终反应吸光值；A2为只加入Tris-HCl缓冲液的吸光值。

1.4.6.5 H2O2清除能力测定

0.6 mL H2O2与1 mL不同浓度多糖溶液、2.4 mL磷酸盐缓冲液混匀，室温反应10 min，测定OD230nm值。以VC为阳性对照[23]。根据公式4计算样品的H2O2清除能力：

式中：A0为未加样品的吸光值，即以磷酸盐缓冲液代替样品；A1为加入H2O2溶液后的吸光值；A2为样品溶液的吸光值。

1.4.6.6 Fe2+螯合能力测定

1 mL不同浓度多糖样品，与0.05 mL FeCl2溶液混匀。向反应体系中加入0.2 mL菲啰嗪溶液，剧烈振荡，室温反应10 min，加水定容至3 mL。测定体系吸光值OD562nm。选取 EDTA·2Na为对照[24]。按照公式（5）计算样品的Fe2+螯合能力：

式中：A0为未加样品的吸光值，即以去离子水代替样品；A1为加入样品溶液后，反应体系的吸光值；A2为以水代替菲啰嗪溶液，反应体系的吸光值，排除样品吸光度的影响。

1.4.6.7 亚硝基（NO2-）清除能力测定

取不同浓度多糖样品置于具塞试管中，加入1 mL NaNO2溶液，37℃孵化2 h，加水至5 mL。按标准曲线绘制方法进行测定，根据标准曲线方程计算NaNO2清除量，并根据公式（6）计算NO2-清除能力[25]：

式中：A0为未加样品的吸光度，即以水代替待测样品；A1为加入样品溶液后，反应体系的吸光值；A2为以水代替NaNO2溶液时，反应体系的吸光值，排除样品吸光度的影响。

1.5 数据处理

每个试验处理均设置3个重复，数据以均值±标准差形式表示，统计检验的显著水平设定为0.05。利用JMP（Version 9.0.2，SAS，Inc）软件进行方差分析及多重比较，并用Sigmaplot（Version 10.0，Systat Software，Inc）软件绘图。

2 结果与分析

2.1 高产EPS LAB的分离与鉴定

本研究从酸菜发酵液中共分离得到4株典型LAB，其中 GX-1、GX-2、GX-3 和 GX-4四株菌可以明显产生EPS且菌株GX-3 EPS含量高于其它3株菌，达到（38.42±2.15）g/L。此外，该菌株产生的 EPS含量显著高于W.confuse KR780676 EPS（17.2 g/L）[26]和Leu.citreum SK24.002 EPS（2.4 g/L）[27]，具有工业大规模生产EPS的潜力。菌株GX-3在MRS培养基上菌落为白色，表面光滑，凸起，不透明，近圆形，边缘整齐。在MRS-S培养基上菌落较大为乳白色，表面光滑，有光泽，附着黏性液体。该菌株革兰氏染色阳性，菌体呈串珠状，无鞭毛，不运动，不产芽孢。生理生化试验以及部分糖发酵试验结果如表1所示。

表1 菌株GX-3生理生化试验检测结果Table 1 Differential phenotypic characteristics of strain GX-3

由表1可知，菌株GX-3能以葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、蔗糖、棉子糖、阿拉伯糖为底物进行发酵，而不能以木糖、鼠李糖为底物进行发酵；且能够利用葡萄糖产酸产气，脲酶及酯酶试验、明胶液化、精氨酸水解试验、淀粉水解、氧化酶试验、过氧化氢酶试验呈阴性。其结果与Leu.pseudomesenteroides生理生化特性基本一致。

16S rDNA序列分析表明，菌株GX-3部分序列长为1321 bp，与该序列相似性较高的相关菌株均为Leuconostoc细菌。菌株GX-3系统发育树如图1所示。

图1 菌株GX-3系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of strain GX-3

由图1可知，该菌株与Leu.pseudomesenteroides DRP-5基因序列的亲缘关系最近，相似性达到99%。结合GX-3生物学特性和生理生化结果分析，将GX-3鉴定为Leu.pseudomesenteroides，并命名为Leu.pseudomesenteroides GX-3。

2.2 EPS的分离纯化

GX-3 EPS经除菌体、除蛋白、乙醇分级沉淀等步骤后，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100进一步层析，样品洗脱图呈现单一对称峰，表明XG5 EPS为分子量相对均一组分。波长扫描结果表明，XG5 EPS在19 nm～200 nm之间有最大的特征吸收峰，为碳水化合物的特征吸收。在260 nm和280 nm处无紫外吸收峰，说明无核酸和蛋白质污染，纯度较高。

2.3 GX-3 EPS化学组成分析

GX-3 EPS的C、H、N及S元素含量分别为（43.27±0.24）%、（7.87±0.02）%、（2.01±0.11）%和 （0.31±0.07）%。总糖、蛋白质、糖醛酸含量分别为（90.98±1.21）%、（0.52±0.03）%和（5.26±0.11）%。其中糖醛酸含量高于Flammulina velutipes EPS[28]，蛋白质含量高于Lb.helveticus MB2-1 EPS-3（0.29%）[29]，低于 Hyriopsis cumingii HCP-3 EPS（9.42%）[19]。

2.4 GX-3 EPS的抗氧化活性

2.4.1 总还原力

具有还原力的化学物质通过提供氢原子来阻断过氧化物的形成，从而破坏自由基反应链，最终发挥抗氧化作用。GX-3 EPS总还原力见图2。

图2 GX-3 EPS总还原力Fig.2 GX-3 EPS on reducing power

如图2所示，GX-3 EPS和VC的总还原力与样品浓度呈正相关，GX-3 EPS的总还原力始终低于VC，但显著高于Pediococcus pentosaceus SR2-2 EPS[23]。

2.4.2 对DPPH·的清除作用

DPPH·是一类较为稳定的合成自由基，能够将其清除的化学物质具有较强的自由基清除能力。GX-3 EPS对DPPH·的清除作用见图3。

图3GX-3 EPS对DPPH·的清除作用Fig.3 The GX-3 EPS on DPPH·clearance ability

如图3所示，GX-3 EPS的DPPH·清除率都随着样品浓度的增加而增大，但始终低于VC的清除能力。GX-3 EPS在5 mg/mL时的清除率最大，为（65.34±3.54）%。张玉龙等研究不同种类ESP对DPPH·的清除能力时发现，当ESP浓度为1.0 mg/mL时，其对DPPH·的清除率为33.53%～41.92%，低于本研究中EPS 对 DPPH·清除率[23]。

2.4.3 对·OH的清除作用

·OH是活性氧中最为危险而且活性最强的自由基，可以通过活体免疫作用产生，自由进入细胞膜，导致氧化应激损伤，尤其是对蛋白质造成破坏[30]。GX-3 EPS对·OH的清除作用见图4。

图4GX-3 EPS对·OH的清除作用Fig.4 The GX-3 EPS on·OH clearance ability

如图4所示。随浓度的增加，GX-3EPS和VC的·OH清除率呈现先升高后趋于平缓的趋势。当质量浓度达到5.0 mg/mL时，二者对·OH的清除率分别达到（78.24±3.52）%（EPS）和（95.56±2.14）%（VC）。崔静等[25]发现EPS6对·OH具有明显的清除作用，在质量浓度为2.0 mg/mL时，清除率高达91.5%，高于本研究中GX-3 EPS对·OH的清除率。

2.4.4 超氧阴离子（O2-·）自由基清除能力

O2-·是一种有毒性的活性氧，可以与大量生物活性分子发生反应，造成蛋白质、DNA、脂质等的氧化损伤。Huang等[31]曾报道，O2-·清除能力与分子中存在的能够促进O-H键释放氢离子的亲电子成分有关，如酮基、醛基等。GX-3 EPS对O2-·的清除作用见图5。

如图5所示。，随着GX-3 EPS和VC浓度的增大，清除率呈现先急速升高后保持平稳的趋势，当浓度大于1 mg/mL时，清除率提高幅度明显减小，在浓度为5 mg/mL时，GX-3 EPS和VC对 O2-·的清除率达到最大，分别为（95.44±4.21）%和（77.48±2.45）%。戚跃明等[32]等研究EPS对O2-·清除能力发现，在浓度为10 mg/mL时，O2-·清除率达到47.4%，显著低于本研究中的EPS清除效率（P＜0.05）。由此可以看出，GX-3 EPS对O2-·具有一定的清除活性，其作为添加剂可以降低机体的损伤程度。

图5 GX-3 EPS对O2-·的清除作用Fig.5 The GX-3 EPS on O2-·clearance ability

2.4.5 H2O2清除能力

H2O2是细胞衰老的诱导因子之一，能够通过细胞膜，与细胞中的Fe2+或是O2-·作用生成·OH，缓慢地氧化机体，对机体造成氧化损伤[33]。GX-3 EPS对H2O2的清除作用见图6。

图6 GX-3 EPS对H2O2的清除作用Fig.6 The GX-3 EPS on H2O2clearance ability

如图6所示，GX-3 EPS的H2O2清除能力随着样品浓度的增加而增大，当样品浓度为5 mg/mL时，清除率为（82.78±3.76）%，显著高于紫枝GSP2 EPS的H2O2清除能力（48.12%）[32]。

2.4.6 Fe2+螯合能力

铜、铁等金属离子参与机体内许多氧化反应，导致机体氧化损伤[19]。GX-3 EPS对Fe2+的螯合能力见图7。

图7 GX-3 EPS对Fe2+的螯合能力Fig.7 The GX-3 EPS on Fe2+chelating ability

由图7可知，随着样品浓度的升高，Fe2+螯合能力呈现先快速上升后保持平稳的趋势，且GX-3 EPS的Fe2+螯合能力低于EDTA-2Na的Fe2+螯合能力差异不显著（P＜0.05）。GX-3 EPS在浓度为 1 mg/mL 的 Fe2+螯合能力达到（92.37±2.34）%，显著高于Lb.graminis SR12-1 EPS[23]和 Enterococcus faecium BDU7 EPS[34]。Ker等曾发现EPS的金属螯合能力与其分子质量有关，且多糖分子的结构、组成及羟基的数量和位置也影响了螯合能力，具有螯合能力的多糖必须含有-OH、C=O、-S-、-O-、-COOH、-O-等官能团。因此可以看出，GX-3 EPS可能具有高分子质量及高分枝度的结构[35]。

2.4.7 NO2-清除能力

亚硝酸盐是一种剧毒物质，也是一种致癌物，在胃部酸性条件下可转变成的亚硝酸。亚硝酸可与胺类物质反应，生成具有强致癌作用的亚硝基胺类化合物，诱发人消化道癌等疾病[36]。GX-3 EPS对NO2-的清除作用见图8。

图8 GX-3 EPS对NO2-的清除作用Fig.8 The GX-3 EPS on NO2-clearance ability

由图8可知，GX-3 EPS具有较高的亚硝酸盐清除能力，在质量浓度为5 mg/mL时，清除率为（38.34±3.28）%，显著高于Pediococcus sp.SR2-1 EPS[（9.35±0.63）%）][23]，但与 VC相比，GX-3 EPS 的 NO2-清除能力较低。

3 结论

本研究筛选得到一株高产EPS的LAB，经生理生化试验、形态学鉴定和分子生物学试验鉴定该菌株为Leu.pseudomesenteroides，并命名为 Leu.pseudomesenteroides GX-3。以该菌株为供试菌株，进行EPS分离纯化，得到高纯度 EPS，其产量为（38.42±2.15）g/L。此外，GX-3 EPS 具有较高的还原力，对 DPPH·、·OH、O2-·、H2O2、和NO2-均具有良好的抗氧化活性，清除效率随着浓度的增加而增强，最高分别为（65.34±3.54）%、（78.24±3.52）%、（77.48±2.45）%、（82.78±3.76）%和（38.34±3.28）%。因此，Leu.pseudomesenteroides GX-3发酵得到的EPS作为天然抗氧化剂具有良好的应用和开发前景。