花朋朋，熊 煜，于志颖，刘 斌，，赵立娜

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.国家菌草工程技术研究中心，福建福州 350002）

小球藻（Chlorella pacifica）是一种单细胞绿藻，属于绿藻门 （Chlorophyra）、绿藻纲 （Chlorophyceae）、小球藻属（Chlorella），具有生长繁殖迅速等特点。小球藻富蛋白质[1]，营养价值高，易于被人体吸收，包含8种人体必需氨基酸，完全能满足人、动物的生长所需，具有很高的应用价值[2-4]。目前，国内外的研究热点是藻类蛋白活性肽，大部分研究主要集中在开发藻类多肽的抗氧化、抗菌、降压、降脂、预防骨质疏松等生物活性免疫调节等功能性生物活性肽[5]，然而对小球藻钙螯合肽活性的研究却不常见。

钙在人体机能中扮演着重要功能作用，当机体摄入钙不足会造成佝偻病、软骨病、骨质疏松等各种疾病，同时会对人类的生命健康造成重大的危害[6。目前市场上钙补充制剂很多，主要有无机钙、有机钙[7]。然而，众多补钙产品的生产及销售并未能从根本上改变人们的缺钙问题，其原因在于一方面人体对钙的摄入不够，另外一方面就是人体机能内部对钙的有效吸收率低[8]，随之而来又有一个弊端，虽然一些有机钙制剂能够可以大量被机体吸收，但会伴随负反馈调节系统失调，反而抑制钙的吸收。目前，已发现多肽具有矿质载体的作用，可与金属离子螯合形成多肽-钙复合物，进而促进小肠对钙的吸收，如牛乳酪蛋白磷酸肽[9]、蛋黄肽、大豆蛋白肽、鱼鳞及鱼骨肽[10-18]。但这些多肽制备价格昂贵，因此小球藻多肽螯合钙以其生物效价高、易吸收、无毒、无刺激作用等优点[19]成为了为第4代补钙制剂，得到了人们的青睐。

试验以小球藻为原料，通过中性蛋白酶酶解法，来制备小球藻多肽，并将其与Ca2+进行螯合，目的在研发具有螯合率较高的小球藻多肽-钙螯合物。利用单因素试验探究了螯合时间、螯合温度、螯合肽钙质量比、螯合底物质量分数和pH值对螯合率的影响。并通过响应面试验优化制备工艺，制得了较高品质的小球藻多肽-钙螯合物。该研究可充分发挥多肽和矿物质元素对人体的双重营养功能特性，为小球藻应用开发提供了一种新的开拓思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小球藻，台湾绿藻工业股份有限公司提供；中性蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司提供；EDTA、氢氧化钾（KOH）、三乙醇胺、钙指示剂、CaCl2、钙羧酸指示剂、无水乙醇和氢氧化钠（NaOH）等，均为分析纯；去离子水，实验室自制。

1.2 仪器与设备

TDL-5-A型低速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司产品；FE20型精密pH计、ZD-2型雷磁电位自动滴定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；FD-3型冷冻干燥机，河北国辉实验仪器有限公司产品；电子分析天平，上海化科实验器材有限公司产品；SHA.B型精达水浴恒温振荡器，常州精达仪器制造有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 小球藻多肽的制备流程[20]

小球藻→去离子水溶解（料液比1∶30）→添加NaOH（溶液质量分数为4%）→在50℃下水浴1 h→6层纱布过滤→离心（5 000 r/min，10 min） →取上清液→调pH值3（30 min） →离心（5 000 r/min，10 min）→沉淀冷冻干燥→小球藻蛋白→去离子水溶解（料液比1∶30）→调整pH值7.5→中性蛋白酶酶解（40℃）→40℃水浴6 h→沸水浴灭酶（10 min）→离心（4 500 r/min，10 min） →上清液（小球藻多肽溶液）→冷冻干燥→小球藻多肽。

1.3.2 小球藻多肽-钙螯合物的制备

称取一定量小球藻多肽复溶成一定浓度的多肽溶液，加入1 mol/L NaOH调整pH值为9.0，按一定质量比加入钙离子（以无水氯化钙的形式），将其放置于一定温度的水浴摇床中充分反应一段时间，反应后置于室温冷却，以转速4 500 r/min离心10 min取上清液，加入5倍体积的95%乙醇溶液，静置沉淀12 h，以转速4 500 r/min离心10 min取沉淀，用无水乙醇对沉淀物洗涤数次，将其置于烘箱中进行低温干燥处理，使无水乙醇挥发，然后进行冻干获得多肽-钙螯合物粉末。

1.3.3 测定总钙含量的测定[21]

反应液与去离子水以0.1∶50（mL∶mL），依此将2~3 mL三乙醇胺、0.8~1.0 mL氢氧化钾溶液、适量钙指示剂加入，摇匀，接着用EDTA溶液滴定，溶液从紫红色变成纯蓝色为终点，记录EDTA体积V0。根据公式计算可得总钙含量M0。

1.3.4 螯合钙含量的测定

反应液与去离子水以0.1∶50（mL∶mL），量筒量入20 mL的乙醇，恒温条件下振摇1 h，以转速3 500 r/min离心10 min，去除上清液，蒸馏水定容20 mL，吸取2 mL此溶液，同1.3.3步骤（EDTA滴定），记录EDTA体积V1。根据公式计算可得螯合钙含量 M1。

1.3.5 钙螯合率的测定

式中：M0——反应液中总钙含量，g；

M1——表示同体积反应液中螯合钙的钙含量，g。

1.3.6 螯合条件单因素试验

（1）螯合时间对钙螯合率的影响。称取小球藻多肽2 g，底物质量分数3%，调整pH值为8，肽钙质量比1∶2水浴摇床温度设置40℃，螯合时间分别为 20，30，40，50，60，70，80 min，测 3 次螯合率。

（2）螯合温度对钙螯合率的影响。取小球藻多肽2 g，底物质量分数3%，调整pH值为8，肽钙质量比1∶2，水浴摇床温度分别设置30，40，50，60，70，80℃，螯合时间50 min，测3次螯合率.

（3）肽钙质量比对钙螯合率的影响。称取小球藻多肽2 g，底物质量分数3%，调整pH值为8，肽钙质量比分别为 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，水浴摇床温度设置50℃，螯合时间50 min，测3次螯合率。

（4）底物质量分数对钙螯合率的影响。称取小球藻多肽2 g，底物质量分数2%，3%，4%，5%，6%，7%，调整pH值为8，肽钙质量比3∶1，水浴摇床温度设置50℃，螯合时间50 min，测3次螯合率。

（5）pH值对钙螯合率的影响。称取小球藻多肽2 g，底物质量分数3%，调整pH值分别为5，6，7，8，9，10，11，12，肽钙质量比3∶1，水浴摇床温度设置50℃，螯合时间50 min，测3次螯合率。

1.3.7 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以钙螯合率为指标，选取4个对钙螯合率影响最显著的因素（螯合温度、肽钙质量比、底物质量分数、pH值），采用Box-Behnken组合方法进行四因素三水平响应面试验设计，同时运用Design Expert 8.1软件设计试验对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 螯合时间对钙螯合率的影响

螯合时间对钙螯合率的影响见图1。

图1 螯合时间对钙螯合率的影响

由图1可知，钙螯合时间在20~50 min时，钙螯合率随螯合时间的延长而升高；当螯合时间在50 min时，钙螯合率最高，达到79%±0.02%；但是，当螯合时间大于50 min时，钙螯合率开始下降。此现象说明螯合时间过长，很容易造成钙螯合物结构的不稳定，反而不利于钙螯合物的发生[22-23]。此结果表明螯合时间对钙螯合率没有显著性差异，说明钙螯合反应迅速，螯合时间对螯合率的影响较小[24]。所以在后续的螯合试验中，选择螯合时间为50 min。

2.1.2 螯合温度对钙螯合率的影响

螯合温度对钙螯合率的影响见图2。

图2 螯合温度对钙螯合率的影响

由图2可知，钙螯合温度在30~60℃时，钙螯合率快速增加；在60℃时，钙螯合率最高，达到85%±0.01%；当螯合温度大于60℃时，钙螯合率开始下降，原因在于一方面温度过高会使氨基酸或者小肽发生羰氨反应，与钙离子形成竞争，导致钙螯合率降低，另一方面温度过低会使螯合反应速率变慢[25-27]。因此螯合温度定位60℃，进行后续响应面优化试验。

2.1.3 肽钙质量比对钙螯合率的影响

多肽与氯化钙质量比对钙螯合率的影响见图3。

图3 多肽与氯化钙质量比对螯合率的影响

由图3所示，当小球藻多肽与钙质量比为3∶1时，钙螯合率最大为87%±0.02%，继续增大氯化钙质量，钙螯合率开始下降；当氯化钙的添加量较小，多肽过量时，使得部分多肽无法与钙离子形成稳定结构，造成了活性多肽的浪费，当Ca2+含量过高时，多肽中的钙螯合位点达到饱和状态，导致大多数钙以游离态的形式出现在反应体系中，最终导致钙螯合率的较低[28]。最终选择肽钙质量比为3∶1，进行后续响应面的优化。

2.1.4 底物质量分数对钙螯合率的影响

底物质量分数对钙螯合率的影响见图4。

图4 底物质量分数对钙螯合率的影响

由图4可知，在底物质量分数为5%时，钙螯合率最大为90%±0.01%，再增加多肽质量浓度钙螯合率反而下降。这可能是因为当多肽浓度较大时，会造成反应体系的黏度系数，减小了二者的接触面积和几率，不利于螯合反应的进行，降低了钙螯合率。最终，选择底物质量分数5%进行后续响应面试验。

2.1.5 pH值对钙螯合率的影响

pH值对钙螯合率的影响见图5。

图5 pH值对钙螯合率的影响

由图5可知，当螯合液在酸性条件下时，钙螯合率较低。这可能是由于H+与Ca2+二者发生对供电子基团的竞争[29]，对小球藻多肽-钙螯合物的生成造成了阻碍。当螯合液pH值在5.0~9.0时，随着pH值的不断升高，钙螯合能力快速升高，在pH值9.0时，钙螯合率最大为96%±0.01%；但pH值超过9.0时，钙含量反而下降，此时可能因为在强碱条件下容易发生了一系列的副反应，导致钙螯合率较低[30]。因此选择pH值为9.0，进行后续响应面优化试验。

2.2 螯合条件响应面试验结果

2.2.1 数学模型的建立及显著性检验

响应面试验设计和结果见表1。

表1 响应面试验设计和结果

如表1所示，以钙螯合率作为响应值，运用Design Expert回归分析软件分析表1中29个试验点的响应值，综合数据分析，各试验单因素对钙螯合率的影响，得出如下回归方程：

响应面二次模型方差分析见表2。

表2 响应面二次模型方差分析

其回归方程达到了极显著水平（p<0.01），且失拟项不显著（p>0.05），表明此建模成功。总决定系数R2=0.945 3，表明该方程是高度显著的，即该模型预测值与实际试验值拟合较好。由表2可知，D，AD，CD，BC，B2，C2，D2项都对钙螯合率有显著的影响，顺序为pH值>肽钙质量比>底物质量分数>螯合温度。从响应面分析图可以直观地看到2个因素间的交互作用对钙螯合率的影响大小，螯合温度、肽钙质量比、底物质量分数、pH值4个因素之间交互作用对钙螯合率的影响。

如表2和图6所示，对钙螯合率影响最显著的交互作用是底物质量分数和pH值，其次是螯合温度和pH值，而肽钙质量比和pH值之间的交互作用，对响应值没有显著差异。

2.2.2 响应面试验分析及对小球藻多肽钙-螯合物制备的优化

通过Design Expert软件综合分析得出的回归方程，让各因素保持不变，只对回归模型进行适宜的纬度调整，从而考查各因素间的交互作用对小球藻多肽-钙螯合物钙螯合率的影响。通过对回归分析结果进行分析，作出响应面和等高线图。

如图6所示，等高线图呈现椭圆形，说明二者交互作用显著，同时相应面图出现最高点，钙螯合率值最大[31]。试验表明，底物质量分数和pH值之间、pH值和螯合时间之间存在着较显著的交互作用。

交互作用对钙螯合率影响的响应面图见图6。

图6 交互作用对钙螯合率影响的响应面图

利用Design Expert软件由所建的数学模型进行参数最优分析，得出小球藻多肽-钙螯合物的钙螯合率最高参数条件为螯合温度54.05℃，肽钙质量比3.13，底物质量分数4.75%，pH值9.02，螯合时间50 min，钙含量的预测值为96.14%，为适合操作，调整条件螯合温度75℃，pH值9，肽钙质量比2∶1，底物质量分数5%，螯合时间60 min，做3组平行试验。对试验进行验证，得结果表明在此条件下螯合率为97.15%±0.001 225%，与预测值无显著性差异（p>0.05）。证明此条件为小球藻多肽钙螯合反应的最优条件，该回归方程可应用于实践。

3 结论

由响应面分析法优化小球藻多肽与钙螯合的最佳工艺条件为螯合温度50℃，pH值9，肽钙质量比3∶1，底物质量分数5%，螯合时间60 min，在此条件下制备的螯合物的钙螯合率为97.15%±0.001 225%，与预测值96.14%没有显著性差异。小球藻多肽和钙离子发生螯合反应，生成了一种新型多肽-钙螯合物，为合成新型补钙制剂的开发与利用提供了理论依据，同时也为小球藻的开发利用提供了一个新的研究思路。