孙学明 孔维信 陆 艺 吴起嵩 朱小东

(1江苏大学附属昆山医院老年医学科 昆山 215300; 2上海交通大学医学院附属苏州九龙医院 苏州 215021;3东部战区总医院国家肾脏病临床医学研究中心 南京 210016)

成纤维细胞生长因子-23(fibroblast growth factor-23,FGF-23)是一种重要的磷代谢调节因子,通过与甲状旁腺细胞FGFR1-Klotho蛋白结合,直接抑制血清全段甲状旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)的分泌及基因的表达。继发性甲状旁腺功能亢进症(secondary hyperparathyroidism,SHPT)患者血清中FGF-23、iPTH水平均显著升高,FGF-23、iPTH代谢异常表现为血、尿磷排泄异常,甲状旁腺功能亢进,佝偻病、骨软化等[1-2]。甲状旁腺组织特征性病理性改变表现为甲状旁腺细胞弥漫性和结节性增生,其中结节性增生患者临床进展较快,预后相对于弥漫性增生患者差。目前,相关病因研究取得了一定进展,但是,甲状旁腺细胞不同病理性增生的确切机制尚不清楚。

Klotho蛋白作为FGF-23重要的辅助因子,抑制肾脏对磷酸盐的重吸收,促进尿磷排泄发挥重要作用。Klotho基因最早由日本学者Kuro-o等[2]在研究自发性高血压时发现,近年来研究证明Klotho具有广泛和重要的生物学作用。Klotho在肾脏的远曲小管、甲状旁腺细胞等组织细胞表达,动物模型研究发现FGF-23与Klotho基因敲除小鼠具有相似的临床表型[2-3]。进一步的研究表明,Klotho在调控机体磷代谢中也起到重要作用,FGF23-Klotho轴影响甲状旁腺素(parathyroidhormone,PTH)的合成与分泌是CKD骨矿物质代谢紊乱(CKD-mineral and bone disorder,CKD-MBD)的发病机制之一。目前有研究指出Klotho可作为肾损伤的标志物之一及肾脏损伤预后指标,FGF-23需与其受体FGFR1结合方能发挥作用,Klotho可促进两者的结合,FGF-23、FGFR1、Klotho三者相互作用影响甲状腺功能,然而三者之间的消长关系及与甲状腺增生病理表现的关系有待进一步深入研究。本研究拟通过测定SHPT患者术前、术后FGF-23水平及其受体FGFR1与Klotho蛋白质在不同增生类型甲状旁腺组织中的表达差异,应用甲状腺组织病理学及电镜超微病理学方法进行对比观察,进一步证实FGF-23、FGFR1及Klotho表达水平与甲状腺组织增生病理性表现的相关性,同时拟通过对术后相关指标检测进一步评价现行甲状旁腺切除手术对继发性甲状旁腺功能亢进症患者的治疗价值。

资 料 和 方 法

研究对象选择2015年1月至2016年10月在苏州九龙医院肾内科住院的SHPT患者。入组标准:(1)年龄大于18周岁的血液透析患者;(2)近1个月病情稳定;(3)至少规律透析3个月以上。排除标准:(1)近1个月内发生急性感染;(2)合并晚期恶性肿瘤;(3)一般情况差,预期生存期不足1年。共入选SHPT患者25例,其中男性11例,女性14例。原发病为慢性肾小球肾炎14 例,高血压病5例,糖尿病5例,成人型多囊肾1例。以同期内该院体检中心的健康志愿者10例作为对照组,其中男5例,女5例,排除慢性肾脏病、肿瘤和急慢性感染。

研究方法治疗组患者于透析当日空腹在动脉端取血,对照组于清晨空腹采肘静脉血。分别检测治疗组和对照组血清iPTH、FGF-23、Klotho、血磷水平,对治疗组行甲状旁腺切除手术,对摘除的甲状旁腺进行称重,检测治疗组患者术后血磷水平、术后48 h FGF-23和iPTH水平。

依据术中所见,将甲状旁腺增生参差明显的患者作为亚组进行分析,即将甲状旁腺组织分为无明显增生组(单个甲状旁腺最长径<15 mm)、弥漫性增生组(单个甲状旁腺长径≥15 mm,且未扪及结节)和结节性增生组(甲状旁腺组织中可扪及结节)3个亚组。结果显示,所有SHPT患者均存在弥漫性增生或结节性增生,有2例患者同时存在弥漫性增生和结节性增生。依据上述分组标准,最终有37 份组织被获取并纳入亚组分析。采用实时定量荧光real-time PCR法检测甲状旁腺组织中FGFR1 mRNA、KLotho mRNA的表达,采用Western blot法检测甲状旁腺组织中的FGFR1及Klotho水平。

实时定量荧光real-time PCR法检测甲状旁腺组织中FGFR1 mRNA及KLotho mRNA的表达利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板(FGFR1 mRNA、KLotho mRNA)的定量分析。操作过程共分为总RNA提取、逆转录、实时定量PCR 3个步骤。

Western blot法检测甲状旁腺组织中的FGFR1及Klotho水平 将电泳分离后的蛋白质(FGFR1、Klotho)从凝胶转移到固相支持物PVDF膜上,然后用ESL底物进行化学发光检测、X光片曝光,经显影定影处理后,胶片用扫描仪扫描,使用Gel-Pro analyzer软件进行灰度分析定量。

采用光镜及电镜观察不同亚组甲状旁腺组织改变。

结 果

研究对象临床特征25例SHPT患者,平均年龄(47.2±6.4)岁,透析龄(52.2±12.3)个月。10例对照组健康志愿者,平均年龄(45.7±9.6)岁。

患者血清FGF-23、Klotho和血磷水平的相关分析采用独立样本的t检验分析数据。患者血清FGF-23水平为(1 352.44±390.84)pg/mL,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);患者血清Klotho水平为(12.16±2.12)pg/mL,明显低于同年龄对照组,差异有统计学意义(P<0.01);患者血磷水平(2.30±0.59)mmol/L,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01,表1)。

全切的甲状旁腺组织质量与术前iPTH的相关分析采用双变量相关分析求得Pearson相关系数分析数据。每一位接受甲状旁腺切除的患者被切除甲状旁腺组织的总质量,其中包括无明显增生(n=10)、弥漫性增生(n=15)和结节性增生(n=12)的甲状旁腺组织,与患者术前血清全段甲状旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)呈正相关,(r=0.623,P=0.001,图1)。

术后48h患者iPTH水平、FGF-23水平、血磷水平与术前的比较采用配对样本的t检验分析数据。术后48 h患者血清iPTH (75.12±32.92)pg/mL较术前明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);术后48 h患者血清FGF-23水平(1 289.05±356.71) pg/mL,与术前相比无明显下降,差异无统计学意义(P=0.13);术后48 h患者血磷(1.56±0.40)mmol/L,与术前相比明显下降,差异有统计学意义(P<0.01,表2)。

表 1 治疗组与对照组指标汇总表Tab 1 Summary of indicators in treatment group and control group ±s)

(1)Compared with the control group,P<0.01.

图1 甲状旁腺组织质量与iPTH相关关系散点图Fig 1 Correlation of parathyroid tissue weight with preoperative iPTH

±s)

Compared with before operation,(1)P=0.13,(2)P<0.01.

1:No obvious hyperplasia group;2:Nodular hyperplasia group;3:Diffuse hyperplasia group.

图2不同增生程度甲状旁腺组织中Klotho和FGFR1电泳图
Fig2ElectrophoretogramaboutKlothoandFGFR1in
parathyroidglandsofdifferenthyperplasiadegrees

不同类型增生甲状旁腺组织中Klotho、FGFR1蛋白及KlothomRNA、FGFR1mRNA的比较采用独立样本的t检验分析数据。无明显增生组的甲状旁腺中的Klotho水平最高,为0.862 5±0.230 4;弥漫性增生组甲状旁腺中的Klotho水平高于结节性增生组,差异有统计学意义(P<0.05,表3);无明显增生组的甲状旁腺中的FGFR1水平最高,为0.816 3±0.124 2,弥漫性增生组的甲状旁腺中的FGFR1水平高于结节性增生组,差异有统计学意义(P<0.05,表3)。

无明显增生组的甲状旁腺中的Klotho mRNA水平和FGFR1 mRNA水平分别与弥漫性增生组和结节性增生组三者之间两两比较,差异无显著性意义(图2,表3)。

不同增生甲状旁腺组织的光镜形态正常甲状旁腺组织中含有3种细胞,分别为主细胞、嗜酸性细胞和透明细胞,主细胞是主要的实质细胞。甲状旁腺的不同类型增生实质是3种细胞从有序到无序增生的过程。在无明显增生组中,细胞较一致,实质细胞主要由主细胞、水样透明细胞和嗜酸性细胞组成,间质有毛细血管,实质细胞与间质脂肪比例相等(图3A)。弥漫性增生组中,细胞排列紧密,增生的细胞主要为主细胞而很少嗜酸细胞,间质有少量或没有脂肪(图3B)。而结节性(腺瘤性)增生组中,由各种细胞组成,细胞排列在纤细毛细血管网周围,偶有分叶或结节状,可见小囊,内含不等量胶样物质,间质中无脂肪(图3C)。

不同增生组织的电镜形态甲状旁腺实质由密集的细胞团组成,与无明显增生组相比,弥漫性增生组中增生的细胞以主细胞为主,大部分主细胞处于活跃的分泌状态,细胞内可见大量的线粒体,丰富的粗面内质网,高尔基复合体发达,高尔基小泡及核糖体多沿液泡周围分布。胞质内见较多分泌颗粒和糖原颗粒,嗜酸性细胞增多。随着增生程度的加重,结节性增生组细胞呈巢状排列,结构趋于紊乱,胞质内见较多的粗面内质网,其他细胞器明显减少,线粒体肿胀、空泡变性或嵴有异常,部分细胞坏死改变(图4)。

表3 分组检测甲状旁腺组织相关指标Tab 3 Indexes related to packet detection of different parathyroid tissues (n,±s)

aThere are 37 parathyroid tissues in 25 cases.Compared with no obvious hyperplasia group,(1)P<0.05.

A:No obvious hyperplasia group;B:Diffuse hyperplasia group;C:Nodular hyperplasia group.

图3不同增生类型甲状旁腺组织的光镜形态(HE,×40)
Fig3Lightmicroscopyofdifferenttypesofhyperplasticparathyroidtissues(HE,×40)

A:No obvious hyperplasia group;B:Diffuse hyperplasia group;C:Nodular hyperplasia group.

图4不同增生组织的电镜形态
Fig4Electronmicroscopicmorphologyofdifferenthyperplastictissues

讨 论

FGF-23是成纤维细胞生长因子家族的成员,是一种由骨细胞和成骨细胞合成的具有内分泌功能的蛋白质,由251个氨基酸组成,相对分子质量为26 000[4]。FGF受体属于酪氨酸激酶型受体,目前发现的共有5种,即FGFR 1～5。FGFR1是FGF-23在肾脏的主要受体,Klotho蛋白质可直接与FGFR1结合。生理情况下,FGF-23作用于甲状旁腺的受体FGFR1和共受体Klotho,抑制甲状旁腺激素的分泌,维持钙磷稳态[5]。FGF-23与Klotho-FGFR1复合物的亲和力远高于单独的FGFR1,因此FGF-23需要Klotho的协助才能发挥作用[6]。在慢性肾功能衰竭合并SHPT时,因肾单位减少导致磷排泄不足,Klotho表达下降,两方面因素导致FGF-23的功能不能充分发挥[7],血清FGF-23代偿性增加。本研究对慢性肾功能衰竭继发性甲状旁腺功能亢进症拟行甲状旁腺切除手术患者手术前血清全段甲状旁腺激素、FGF-23和Klotho蛋白质、血磷水平等指标进行了横向分析,检测结果表明患者血清的PTH、FGF-23和血磷水平均明显高于健康人群。居高不下的FGF-23水平却不能下调PTH水平,分析原因考虑与Klotho蛋白质水平低下密切相关。Klotho在慢性肾功能衰竭合并继发性甲状旁腺功能亢进症血清中的低表达,直接导致Klotho蛋白质与FGFR1可结合数量下降,FGF-23不能有效抑制甲状旁腺激素的分泌,即甲状旁腺细胞对FGF-23的产生了抵抗。亚组分析显示,结节性增生患者甲状旁腺组织中的Klotho和FGFRl水平更低,相应的情况也就更糟。

本研究结果显示切除甲状旁腺组织的总质量与血清全段甲状旁腺激素中等程度相关,有益于外科手术术前评估;术后48 h患者血清iPTH明显下降,而血清FGF-23水平尚无明显变化,患者血清磷水平却已降至正常,印证了血清iPTH是直接的调磷激素。

本研究对甲状旁腺增生参差明显的患者甲状旁腺进行亚组分析,比较其在光镜及电镜下的异同。我们发现,无明显增生组甲状旁腺组织在光镜和电镜下表现一致,均为主细胞、大细胞、嗜酸性粒细胞和移行细胞,且这些腺体细胞的特点是形状和尺寸一致[8]。在光镜下,弥漫性增生组和结节性增生组形态基本相同,均可见较多的主细胞、较少的嗜酸细胞增生。而在电镜下,弥漫性增生组和结节性增生组形态则有明显差异,具体表现为弥漫性增生组细胞中可见大量的线粒体,丰富的粗面内质网,高尔基体复合体发达,主细胞处于活跃的分泌状态;而结节性增生组细胞中的细胞呈巢状排列,结构趋于紊乱。简言之,结节性增生甲状旁腺组织中明显正常大小的腺体为低活性状态[9]。本研究所入组的患者行甲状旁腺切除的目的是为了从去除甲状旁腺激素产生的源头,阻断钙磷代谢诸多环节中最重要的一环,所以在除外恶性肿瘤情况下,术后甲状旁腺病理类型似乎不具有重大意义。通过对光镜和电镜的对比分析,我们认为宏观大体标本的形态质地对甲状旁腺增生判定有一定的误差,采取常规光镜检查显示腺体的大小形态,同时电镜观察甲状旁腺主细胞的功能状态,方能最终诊断或否定结节样增生[10]。

本研究发现:无明显增生的甲状旁腺组织中的Klotho和FGFRl水平略高,与弥漫性增生患者相比,结节性增生患者甲状旁腺组织中的Klotho和FGFRl水平最低。提示与正常甲状旁腺相比,增生的甲状旁腺Klotho蛋白表达显著减少,且随着甲状旁腺病理程度的进展而进一步下降,与文献一致[11]。如电镜所见,弥漫性增生组和结节性增生组均可见较多主细胞,两者的不同点在于结节性增生组甲状旁腺主细胞虽多但活性低,趋向无功能。正常情况下,甲状旁腺主细胞分泌PTH,成骨细胞分泌FGF23,借助Klotho的协助,FGF23与甲状旁腺细胞表面的FGFR1结合,发挥其调节钙磷代谢的正常生理作用,可以说此时FGF23和PTH是低水平的互为消长的状态。对于SHPT患者,该平衡被打破,肾脏排磷障碍、血磷进行性升高触发甲状旁腺主细胞增生以分泌更多的PTH,同时高磷刺激成骨细胞分泌更多的FGF23,由于高磷、低活性维生素D、低血钙持续存在,FGF23与PTH之间的对抗不断升级,甲状旁腺和全身骨骼系统随之发生一系列变化,甲状旁腺机能亢进、骨质疏松接踵而至,相对于骨骼系统,甲状旁腺中发生的变化因集中而明显。我们观察到,随着甲状旁腺增生的进展,Klotho和FGFRl水平呈进行性下降趋势,不同增生程度的甲状旁腺组织中的Klotho mRNA和FGFR1 mRNA水平无显著差异。目前我们的研究尚无法从机制上清晰地阐明这一切发生的因果或先后顺序。FGFRl和Klotho表达降低导致FGF-23通过MAPK通路直接作用于甲状旁腺,使之降低PTH的作用受阻,反馈刺激产生更高水平的FGF-23来代偿维持机体的平衡[12]。我们的研究证实,甲状旁腺组织中Klotho表达水平可能是导致SHPT患者甲状旁腺呈不同增生方式的重要原因,与文献结论一致[13]。

电镜下3个亚组比较,弥漫性增生组细胞中主细胞最活跃,Koltho和FGFRl水平却在结节性增生组最低,说明SHPT患者甲状旁腺中Koltho表达水平与主细胞功能不存在直接的线性关系,此现象与我们所熟知的Klotho在肾脏的远曲小管和甲状旁腺细胞等组织细胞表达这一经典理论有所不同。我们认为甲状旁腺细胞在增生过程中除了分泌甲状旁腺激素之外,其他内分泌功能的缺失是主要原因,Koltho和FGFRl表达水平的下降是结果而不是原因,随着病情的进展,细胞间接触抑制功能缺失,从弥漫增生到结节增生,甚至甲状旁腺恶性肿瘤随之而来。引起SHPT患者甲状旁腺中Koltho和FGFRl表达水平下降的其他可能原因还有血磷和FGF23的调节、循环Klotho的负反馈等。我们认为,甲状旁腺组织中Klotho表达水平高低与甲状旁腺的增生方式有密切关联,Klotho表达水平越低越倾向于结节性增生。

总之,慢性肾功能衰竭合并继发性甲状旁腺功能亢进症,合并高磷血症时,甲状旁腺切除手术可以有效地控制病情,改善钙磷代谢[14-15]。增生的甲状旁腺组织中Klotho蛋白质表达显著减少,过低的Klotho蛋白质直接决定了甲状旁腺组织继续增生的方式方向。不同增生程度的甲状旁腺对相关生化指标的贡献明显不同,结节增生的甲状旁腺决定了患者FGF-23和Klotho的水平,为了及时地干预病程,当患者存在严重钙磷代谢紊乱,体检或超声可证实存在结节样增生时,患者甲状旁腺增生、甲状旁腺激素升高、FGF-23代偿性升高、甲状旁腺组织中的Klotho和FGFRl水平下调,FGF-23水平明显升高,甲状旁腺细胞对FGF-23的抵抗加剧,甲状旁腺激素升高,肾功能进一步恶化等情况。为打断上述恶性循环,应动员患者尽早接受治疗,通过甲状旁腺切除手术可有效降低血清iPTH水平,改善钙磷代谢,从而改善整体状况。若条件允许,可对术后甲状旁腺组织行常规病理光镜和电镜检查,以更准确地判断增生的性质,为下一步的科学治疗奠定基础。