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(吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室,湖南张家界 427000)

柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物,具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效,可用于合成甜味剂新橙皮苷和新橙皮苷二氢查耳酮[1]。自然界中,柚皮苷主要存在于芸香科植物柚(CitrusparadisiMacfadyen)的果实中,其含量随果实的膨大而快速下降,成熟后,92%的柚皮苷分布于果皮[2]。我国柚类品种繁多,在南方各地均有种植,菊花芯柚是湖南省张家界市永定区特有的品种,从实生柚树芽变中选育,因果脐部有放射状沟纹,似菊花形而得名[3]。有众多学者对柚皮苷的提取制备方法进行了系统研究,例如,许有瑞等[4]采用乙醇热回流提取沙田柚幼果,收率为26.04%;周强等[5]选择碱提酸沉法提取柚皮,收率达1.82%,优于常规浸提法;朱名毅等[6]采用50%乙醇辅助超声提取沙田柚柚皮,收率达到6.14%。

双水相萃取技术作为一种新型液/液萃取分离技术,具有易于放大、可连续化操作、易集成技术和绿色环保等优点[7]。经过发展,双水相体系的组成趋于多样,其应用已拓展到天然次生代谢产物分离领域。其中由乙醇或丙醇跟无机盐组成的一类双水相体系,辅助超声波、微波或浮选技术后,能简化分离工艺,提高分离效率,在天然活性成分分离中具有独特的优势,应用较多,比如,降香中鹰嘴豆芽素A[8]、丹参中紫草酸B[9]、金银花中黄酮和糖[10]、木豆根中染料木素和芹菜素[11]、苦参中苦参碱和氧化苦参碱[12]、竹叶中叶绿素[13]。课题组关于醇/盐双水相体系进行了系统研究[14-15],采用乙醇/NaH2PO4双水相萃取与超声波、浮选技术联用,实现了栀子[14]及杜仲叶[15]中环烯醚萜的提取分离,研究中通过绘制乙醇、正丙醇、异丙醇与NaH2PO4和(NH4)2SO4的双水相体系相图,发现乙醇、正丙醇和异丙醇的分相能力依次为:正丙醇>异丙醇>乙醇,正丙醇可以展现出相对较宽的分相范围,通过无机盐分相能力对比,发现NaCl不能作为分相盐,K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4均能形成双水相体系,其中分相能力最好的是(NH4)2SO4,能够在盐量较少的情况下分相。

本文选择正丙醇和(NH4)2SO4用于构建双水相体系,辅助超声波技术,进行菊花芯柚皮中柚皮苷的提取工艺研究,并借助正交实验确定最优提取条件,研究成果实现了柚皮中柚皮苷提取和分离同步完成,提高了其分离效率,为双水相萃取技术在天然二氢黄酮提取分离方面的应用提供了借鉴,为柚皮苷的工业化生产提供了理论依据,为大量废弃柚皮资源附加值的增加及利用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊花芯柚 采于湖南省张家界市永定区枫香岗菊花芯柚基地;柚皮苷对照品(批号:110722-201312,纯度为94.7%) 中国食品药品检定研究院;正丙醇和(NH4)2SO4均为分析纯;色谱甲醇 天津康科德科技有限公司;水 为去离子水。

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(配G1311C四元梯度泵,G1315D DAD检测器,G1316A柱温箱和Agilent Chemstation B.04.03工作站) 美国安捷伦科技公司;DF-101C型集热式恒温加热磁力搅拌器 河南予华仪器有限公司;GZX-9146-MBE数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;EASY15超纯水仪 青岛市力康生物医疗科技控股有限公司;SB-25-12DT型超声波清洗仪 宁波新艺生物科技股份有限公司;TDL-40B型离心机 上海安亭科学仪器厂;YB-2000A型高速多功能粉碎机 浙江永康市运邦工贸有限公司;AL204型万分之一天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司;pH计 梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菊花芯柚预处理 菊花芯柚剥皮,去除残余果肉及果皮杂质,阴干,用粉碎机粉碎,过50目筛子,将过筛后的粉末置于60 ℃烘箱中干燥至恒重,并保存于干燥器中备用。

1.2.2 双水相分相 利用小分子醇能跟一些无机盐水溶液作用形成双水相体系的机理,采用浊点法[14]绘制双水相相图,确定双水相的分相范围。浊点法操作步骤为:在锥形瓶中精密称取一定量的无机盐,加水溶解,配制成一定浓度无机盐水溶液,然后用滴定管精密加入一定量的小分子醇,当溶液变浑浊时即为滴定终点,当醇或无机盐的量加入过多时,无机盐析出。

1.2.3 柚皮中柚皮苷的双水相提取 选择15 mL具塞PP 离心管作为提取器具,先用万分之一电子天平精密称取一定量的(NH4)2SO4无机盐置于离心管,然后用移液管准确添加一定体积的去离子水,振荡溶解后,再用移液管准确加入一定体积的正丙醇(根据密度换算成质量),构建总质量为10.0 g的正丙醇/盐双水相体系,随后,再准确称取一定质量的柚皮粉末加入到已构建的10.0 g双水相体系中,采用超声波清洗仪在一定温度和时间下提取;为促使双水相体系分相彻底,提取结束后采用离心机以4000 r/min转速离心15 min,静止后上下两相界面清晰,残渣全部集中于离心管底部。过滤后,将上下相溶液全部转移到带刻度的玻璃管内,分别记录上、下相体积。

1.2.4 单因素实验 实验构建的双水相体系总质量为10.0 g,包括正丙醇、(NH4)2SO4和水,采用单因素均分法依据1.2.3步骤,固定超声波功率为240 W,研究(NH4)2SO4质量分数、正丙醇质量分数、柚皮加入量、pH、超声温度及时间6个因素对柚皮中柚皮苷得率的影响。

1.2.4.1 (NH4)2SO4质量分数对柚皮苷得率的影响 固定正丙醇质量分数为22%,30 ℃和30 min超声条件下,调pH至5.0,加入0.10 g柚皮,考察(NH4)2SO4质量分数分别为14%、17%、20%、23%、26%时对柚皮苷得率的影响。

1.2.4.2 正丙醇质量分数对柚皮苷得率的影响 固定(NH4)2SO4质量分数为17%,30 ℃和30 min超声条件下,调pH至5.0,加入0.10 g柚皮,考察正丙醇质量分数分别为17%、20%、23%、26%、29%时对柚皮苷得率的影响。

1.2.4.3 柚皮加入量对柚皮苷得率的影响 固定正丙醇和(NH4)2SO4质量分数组成比例为20%/17%,30 ℃和30 min超声条件下,调pH至5.0,考察柚皮加入量分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g时对柚皮苷得率的影响。

1.2.4.4 pH对柚皮苷得率的影响 固定正丙醇和(NH4)2SO4质量分数组成比例为20%/17%,30 ℃和30 min超声条件下,柚皮加入量为0.20 g,考察pH分别为1、3、5、7、9时对柚皮苷得率的影响。

1.2.4.5 超声温度对柚皮苷得率的影响 固定正丙醇和(NH4)2SO4质量分数组成比例为20%/17%,30 min超声时间下,柚皮加入量为0.20 g,考察超声温度分别为30、40、50、60、70 ℃时对柚皮苷得率的影响。

1.2.4.6 超声时间对柚皮苷得率的影响 固定正丙醇和(NH4)2SO4质量分数组成比例为20%/17%,30 ℃超声温度下,柚皮加入量为0.20 g,考察超声时间分别为10、20、30、40、50 min时对柚皮苷得率的影响。

1.2.5 正交试验 根据单因素实验结果,以双水相上相中柚皮苷的得率(Y)为指标,选取对柚皮苷得率影响较大的(NH4)2SO4质量分数、正丙醇质量分数、柚皮干粉加入量和pH4个因素作为考察因素,进行四因素三水平L9(34)正交试验,优化柚皮中柚皮苷提取工艺条件,采用软件正交设计助手设计实验方案,因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

1.2.6 超声辅助双水相提取柚皮苷含量的测定 柚皮干粉经超声辅助双水相提取后,柚皮苷主要富集于上相,下相为盐相。经过0.45 μm有机膜过滤,进行HPLC检测。

1.2.6.1 柚皮苷对照品溶液的配制和测定 按对照品使用要求将柚皮苷从安瓿瓶中快速取出,并精密称取12.8 mg,放置于25 mL 容量瓶中,加入适量50%甲醇水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,配成484.90 μg/mL 的柚皮苷对照母液。采用逐级稀释法,用移液枪分别移取一定体积的对照母液于5 mL容量瓶,用50%甲醇稀释定容,配制成质量浓度分别为12.12、24.24、48.49、96.98、193.96 μg/mL对照品溶液,经0.45 μm有机膜过滤后,进行HPLC检测,并绘制标准曲线。

1.2.6.2 HPLC检测方法 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相甲醇和0.1%磷酸水溶液的体积比为40∶60,检测波长282 nm,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量为20 μL。

1.2.6.3 柚皮苷得率的计算 通过得率来评价双水相的提取效果,以上相中柚皮苷含量计算柚皮苷得率(Y),公式为:

式中:Ct为上相中柚皮苷的浓度(μg/mL),Vt为上相溶液的体积(mL),Md为柚皮干粉加入量(mg)。

1.2.7 双水相提取放大实验 依据最优试验点进行100倍放大研究,称取180 g(NH4)2SO4于烧杯中,加610 g去离子水,充分溶解,然后添加210 g正丙醇,构建1000 g双水相体系,加15 g柚皮粉末,调pH至4.5,密封,40 ℃条件下,超声波提取30 min。抽滤得滤液,静止分相,进行HPLC检测。

1.2.8 热回流对比实验 依据《中华人民共和国药典2015版一部》枳壳中柚皮苷的提取方法作为参考,称取柚皮干粉约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定重量,加热回流1.5 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀即得,进行HPLC检测。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 19.0版本进行正交实验数据的方差分析和显著性检验,采用EXCEL 2007进行图表分析。

2 结果与分析

2.1 柚皮苷测定及线性考察

按照“1.2.6.2项”下的色谱条件进行柚皮苷含量测定,柚皮苷对照(48.49 μg/mL)及最优条件下柚皮苷在双水相上、下相中的色谱图见图1。在对照品线性关系考察中,以质量浓度为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得回归方程:Y=30717X+25.31(R2=0.9990),在质量浓度为12.12～484.90 μg/mL范围内线性关系和精密度良好,加标回收率为99.20%。同时取48.49 μg/mL的对照品溶液,连续进样6次,结果显示柚皮苷保留时间的RSD为0.63%,峰面积的RSD为0.56%。

图1 不同样品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC analysis of samples obtained from various extraction steps注:A对照品,B上相,C下相。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 (NH4)2SO4质量分数的影响 实验结果见图2,随着(NH4)2SO4用量的不断加入,双水相相比逐渐增大,柚皮苷得率整体呈现倒“V”型趋势,在(NH4)2SO4质量分数为17%时柚皮苷得率达到最大3.37%,当体系中(NH4)2SO4质量分数增加时,柚皮苷得率变小,可能是由于水相中(NH4)2SO4含量增大,盐的助溶作用增强,使得柚皮苷更易于富集于水相。所以后续研究选择(NH4)2SO4的质量分数的最佳点为17%。

图2 (NH4)2SO4质量分数对柚皮苷得率的影响Fig.2 Effect of(NH4)2SO4 mass fraction for the yield of naringin

2.2.2 正丙醇质量分数的影响 正丙醇具有良好的分相能力,是影响柚皮苷分离效率的关键因素。实验结果见图3,在正丙醇质量分数由低到高变化过程中,柚皮苷得率呈现先变大后变小的趋势,在质量分数为20%时达到最大值3.31%,可能是由于随着正丙醇含量的增大,一些脂溶性杂质更多的溶出,影响了柚皮苷在上相的富集。所以选用20%(w/w)正丙醇双水相体系进行后续研究。

图3 正丙醇质量分数对柚皮苷得率的影响Fig.3 Effect of 1-propanol mass fraction for the yield of naringin

2.2.3 柚皮干粉加入量的影响 柚皮中化学成分非常复杂,主要有柚皮苷、新橙皮苷及果胶等,为了进一步优化柚皮苷的提取效果受料液比的影响,考察了柚皮干粉加入量的影响。实验结果见图4,柚皮干粉加入量在0.20 g,柚皮苷得率达到最大值3.47%,增大柚皮干粉,柚皮苷得率则下降明显,最低至2.63%。可能是由于柚皮干粉加入量为0.20 g时,柚皮苷在上相中溶解达到饱和,随着柚皮干粉加入量的增加,体系中果胶等杂质也在增加,增加了固液分离的难度,减弱了双水相体系的分离效果,导致柚皮苷得率下降。所以柚皮干粉加入量选用0.20 g。

图4 柚皮干粉加入量对柚皮苷得率的影响Fig.4 Effect of sample loading for the yield of naringin

图5 pH对柚皮苷得率的影响Fig.5 Effects of pH for the yields of naringin

2.2.5 超声温度的影响 辅助超声波提取时,温度是影响中药活性成分的提取效率的一个重要因素。实验结果见图6,温度由30～50 ℃变化时,柚皮苷得率变化不明显,40 ℃时得率为3.80%,50 ℃时为3.82%,当温度超过60 ℃后,柚皮苷的得率下降。柚皮中含有大量的果胶,温度升高后,会促使果胶溶出,导致柚皮苷得率下降,实验选用40 ℃作为提取温度。

图6 超声温度对柚皮苷得率的影响Fig.6 Effect of temperature for the yield of naringin

2.2.6 超声时间的影响 时间同样会影响双水相提取柚皮苷的得率,实验结果见图7,在30 min时,柚皮苷得率达到最大值3.84%;超过30 min后,柚皮苷得率略有下降。可能是随着时间延长,细胞中有更多杂质溶出,影响双水相的选择性分配,导致柚皮苷得率下降。所以时间选用30 min。

图7 时间对柚皮苷得率的影响Fig.7 Effect of time for the yield of naringin

2.3 正交试验结果及数据分析

2.3.1 正交试验设计方案及结果 单因素实验结果显示,(NH4)2SO4质量分数(A)、正丙醇质量分数(B)、柚皮干粉加入量(C)和pH(D)4个因素对柚皮苷得率有较大影响,因此选择L9(34)正交表进行实验,超声温度选择40 ℃,时间设定30 min。由软件正交试验设计助手设计的实验方案及结果见表2。

表2 L9(34)正交试验设计及结果(n=3)Table 2 Design and results of L9(34)orthogonal tests(n=3)

2.3.2 正交实验直观分析 正交实验直观分析中因素极差值越大,则该因素对实验结果的影响程度就越大,某一水平k值越大,则优水平为该水平,根据表2数据的直观分析,通过比较各个因素的k值和R值,可以看出影响柚皮苷得率的主次因素为:(NH4)2SO4质量分数(A)>pH(D)>柚皮粉加入量(C)>正丙醇质量分数(B),最优水平为A3D1C1B3,即最优条件为:10.0 g双水相体系中,(NH4)2SO4质量分数为18%,正丙醇质量分数为21%,柚皮干粉加入量为0.15 g,pH为4.5,超声波提取温度为40 ℃,时间为30 min。

2.3.3 正交实验方差分析 选定4个因素,采用L9(34)正交表进行实验,方案中无空白列用于统计实验误差,因此,分析通过重复试验来统计实验误差,每个组合方案重复3次,共27组数据。采用SPSS 19.0软件进行单变量有重复方差分析,结果见表3。依据各因素F值和显著性水平判断,因素(NH4)2SO4质量分数(A)、pH(D)和柚皮粉加入量(C)对柚皮苷得率的影响非常显著,正丙醇质量分数(B)影响显著。

表3 正交实验方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal tests

2.3.4 验证、放大及对比实验 依据正交设计中最优条件,10.0 g双水相体系中,(NH4)2SO4质量分数为18%,正丙醇质量分数为21%,柚皮干粉加入量为0.15 g,pH为4.5,超声波提取温度为40 ℃,时间为30 min。进行验证,3次平行实验柚皮苷得率为4.27%,RSD为1.23%,表明该设计给的最优工艺条件稳定可行,重复性良好。

依据“1.2.7”项进行放大研究,柚皮苷得率为4.25%,得率略小于验证实验,上相经浓缩后,用50%乙醇水溶液溶解重结晶,得到柚皮苷约4 g,经HPLC测量纯度达到95%。依据“1.2.8”项进行柚皮的热回流提取,柚皮苷得率为4.10%,小于4.27%,对比发现,超声辅助双水相提取具有时间短、温度低、能耗小、稳定性好、得率高等优点,效果优于热回流提取。

3 结论

本文系统研究了超声波辅助正丙醇/(NH4)2SO4双水相体系提取分离菊花芯柚果皮中柚皮苷的工艺条件。确定最优提取工艺为:10.0 g双水相体系中,正丙醇质量分数为21%,(NH4)2SO4质量分数为18%,柚皮干粉加入量为0.15 g,pH为4.5,超声温度40 ℃,时间为30 min,经3次验证实验后,柚皮苷得率为4.27%,RSD为1.23%,依据最优条件进行100倍放大研究,经HPLC检测,柚皮苷得率为4.25%,与传统热回流提取方法对比发现,超声辅助双水相提取具有时间短、温度低、能耗小、稳定性好、得率高等优点,优势明显。该工艺具有操作简单、成本低廉、设备要求低、易放大生产等优点,为工业制备柚皮苷提供了一定理论基础和科学依据。