戴卓睿姜 凯

在男性群体中，前列腺癌是临床上发病率占第二位的恶性肿瘤，严重威胁男性健康和生活质量[1]。目前，对于早期前列腺癌，手术切除肿瘤组织是临床上最有效的治疗方法，但对于中晚期前列腺癌患者而言，由于癌细胞的扩散，患者需要进行系统性免疫治疗或化疗以提高其生活质量和生存率[2-3]。肿瘤坏死因子诱导凋亡配体（tumor necrosis factor，TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL） 是一种属于TNF超家族的细胞因子[4]，它能选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，却不影响正常组织细胞的功能，因此TRAIL是一种有良好前景的新型低毒肿瘤治疗药物[5-6]。然而，很多患者体内的前列腺细胞对TRAIL治疗并不敏感[7]，因此联合辅助治疗药物提高肿瘤细胞对TRAIL敏感性是改善其抗肿瘤治疗的重要策略。

1 材料与方法

1.1 材 料 RPMI-1640培养基（批号11875085）购于美国Gibco。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（批号 APOAF）、N-乙酰半胱氨酸 （NAC）（批号1009005）、二氢乙啶（DHE）（批号 D7008）、噻唑蓝（MTT）（批号 M2128）和槲皮素（批号 1592409）购于美国 Sigma-Aldrich。TRAIL（批号 P50591）购于美国R&D Systems。SIRT1 抗体（批号 #2493）、死亡受体 5（DR5）抗体（批号 #8074）、caspase-8（批号 #9746）、caspase-3抗体（批号#9665）和GAPDH抗体（批号#5174）购于美国Cell Signaling公司。增强型化学发光底物（ECL）试剂盒（批号32106）购于美国Pierce。脂质体2000（批号11668019）购于美国Invitrogen。

1.2 细胞培养 人前列腺癌细胞系PC3（批号CRL-1435）购于美国模式培养物典藏所（ATCC）。细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.3 SIRT1质粒构建和转染 人SIRT1基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成SIRT1重组过表达质粒。SIRT1过表达质粒用脂质体2000按试剂操作说明书步骤进行转染，简要步骤如下：将2μg/mL质粒用脂质体2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的PC3细胞置于该无血清培养基孵育6h后弃去无血清培养基并加入新鲜的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养24h。

1.4 细胞活力检测 将质粒转染后的PC3细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、槲皮素组、TRAIL组，TRAIL+槲皮素组，TRAIL+槲皮素+SIRT1质粒组和TRAIL+槲皮素+NAC组。对照组为空质粒转染的PC3细胞不加药物培养48h，TRAIL组为在空质粒转染的PC3细胞中加入2μmol/L的TRAIL培养48h，槲皮素组为在空质粒转染的PC3细胞中加入10μmol/L的槲皮素培养48h，TRAIL+槲皮素组为在空质粒转染的PC3细胞中加入2μmol/L的TRAIL和10μmol/L的槲皮素培养48h，TRAIL+槲皮素+SIRT1质粒组为在SIRT1质粒转染的PC3细胞中加入2μmol/L的TRAIL和10μmol/L的槲皮素培养48h，TRAIL+槲皮素+NAC组为在空质粒转染的PC3细胞中加入 2μmol/L 的 TRAIL、10μmol/L 的槲皮素和2mmol/L NAC培养48h。药物处理完毕后在PC3培养孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培养4h，小心吸去上清液，往孔中加入150μL二甲亚砜，充分震荡后在570nm波长下用酶标仪检测OD值，PC3细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

1.5 细胞凋亡实验 对PC3细胞按上述进行分组处理。处理完毕后按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书用Annexin-V对细胞进行染色孵育20min。之后采用流式细胞术检测PC3细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.6 ROS测定 对PC3细胞按上述进行分组处理。药物处理完毕后在PC3细胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min，采用流式细胞术检测PC3细胞中ROS的水平。红色荧光越强则ROS水平越高[8]。

1.7 Western blot实验 对PC3细胞按上述进行分组处理。药物处理完毕后将细胞用蛋白提取液提取总蛋白质。之后将提取的总蛋白质用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到醋酸纤维素膜上，用SIRT1抗体、DR5 抗体、caspase-8、caspase-3 抗体和GAPDH抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.8 统计学方法 实验重复3次，实验数据用均数±标准差（x±s）表示并用SPSS14.0统计分析软件进行处理，组间均数的比较采用单因素方差分析（ne-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素辅助治疗提高PC3细胞对TRAIL的敏感性 MTT和流式细胞实验结果显示，TRAIL+槲皮素组PC3细胞的细胞活力抑制率和凋亡诱导率均显著高于TRAIL单治疗组和槲皮素单治疗组（P＜0.05），见表1，表明槲皮素辅助治疗能显著提高前列腺癌细胞对TRAIL诱导的凋亡的敏感性。

2.2 槲皮素抑制PC3细胞SIRT1表达提高其对TRAIL治疗的敏感性 Western blot实验结果显示，TRAIL处理对PC3细胞SIRT1的表达水平无影响，而槲皮素处理能明显抑制PC3细胞SIRT1表达水平（图1）。为了研究槲皮素发挥对TRAIL增效作用的机制是否和SIRT1表达的下调有关，笔者在PC3细胞中转染SIRT1质粒使SIRT1蛋白强制高表达。实验结果显示，转染SIRT1质粒能显著降低PC3细胞在槲皮素和TRAIL联合治疗下的细胞活力抑制率和凋亡诱导率（表1），表明槲皮素通过抑制前列腺癌细胞中SIRT1的表达水平增强TRAIL对前列腺癌细胞的杀伤活性。

图1 槲皮素和TRAIL对PC3细胞SIRT1表达水平的影响

表1 槲皮素和TRAIL对PC3细胞的细胞活力抑制率和凋亡诱导率的影响（%，x±s）

2.3 槲皮素通过SIRT1/ROS/DR5途径提高TRAIL对PC3细胞的凋亡诱导活性 流式细胞实验结果显示，槲皮素能显著增强TRAIL对PC3细胞ROS的诱导产生，但转染SIRT1质粒后，槲皮素不能促进ROS的产生（图2），表明槲皮素能通过抑制SIRT1表达促进TRAIL依赖的ROS的生成。Western blot实验结果显示，槲皮素联合TRAIL显著诱导PC3细胞DR5的高表达，但用SIRT1质粒或ROS清除剂NAC[9]处理后，槲皮素不能促进DR5的表达（图3），表明DR5受SIRT1/ROS途径的调控。同时，槲皮素联合TRAIL能显著诱导PC3细胞caspase-8和caspase-3的活化，而转染SIRT1质粒或采用NAC处理均能抑制这些caspases的活化（图3）和凋亡的发生（表1），表明槲皮素通过SIRT1/ROS/DR5途径提高TRAIL对PC3细胞的凋亡诱导活性。

图2 TRAIL和槲皮素对PC3细胞ROS产生水平的影响

图3 槲皮素促进DR5表达和caspase-8、caspase-3活化

3 讨论

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，有很好的抗氧化和抗炎作用。近几年的研究表明，槲皮素还有一定的抗肿瘤效应，文献[10]报道槲皮素能抑制神经胶质瘤细胞的增殖和迁移；槲皮素还能通过损伤肺癌细胞的细胞骨架而发挥抗肿瘤活性[11]。文献[12-14]报道中药活性成分在化疗中能起到较好的协同作用，如雷公藤红素能抑制抗凋亡蛋白Bcl-w和PKM2的表达降低宫颈癌及肝癌细胞的化疗耐药性，欧前胡素能通过抑制口腔癌细胞中MCL-1的表达增强顺铂对其的杀伤活性，说明中药活性成分的联合治疗可能是提高化疗疗效的一个重要策略。本研究发现槲皮素联合处理能显著提高前列腺癌细胞在TRAIL治疗下的细胞活力抑制率和凋亡率（P＜0.05），表明槲皮素能作为一种辅助治疗药物增强TRAIL对前列腺癌细胞的杀伤活性，发挥对TRAIL的协同作用，降低前列腺癌对TRAIL的抵抗性。

研究[15-16]表明，TRAIL能诱导肿瘤细胞发生凋亡，它能与肿瘤细胞表面的DR5发生结合，从而激活caspase-8依赖的外源性凋亡通路，进而活化caspase-3，使肿瘤细胞发生凋亡性死亡。因此，肿瘤细胞表面DR5的表达水平决定了其对TRAIL治疗的敏感性。SIRT1属于组蛋白去乙酰化酶蛋白家族成员。研究[17-18]表明，SIRT1的表达水平与肿瘤细胞对化疗的敏感性有关，肿瘤组织SIRT1表达越高则药物治疗的疗效越差，因此SIRT1已成为肿瘤治疗的一个重要靶点。在SIRT1信号通路中，ROS发挥了重要作用，SIRT1能清除细胞中的ROS[19]。有文献[20-21]报道肿瘤细胞中的ROS能诱导DR5的高表达，因此肿瘤细胞中SIRT1的高度表达能抑制TRAIL对ROS的诱导生成，从而减少DR5的表达而使肿瘤细胞产生对TRAIL的抵抗性。

本研究发现，槲皮素在前列腺癌细胞中的直接靶点是SIRT1蛋白，槲皮素辅助治疗能显著降低肿瘤细胞中SIRT1的表达水平，当在细胞中转染SIRT1质粒强制增加它的表达水平后，槲皮素对TRAIL的协同抗前列腺癌活性受到明显抑制。另外，笔者发现槲皮素能明显促进TRAIL依赖的ROS的产生及其下游DR5的表达，而在细胞中转染SIRT1质粒强制增加它的表达水平后，槲皮素对ROS产生和DR5表达的促进作用受到明显抑制，表明槲皮素能通过SIRT1/ROS/DR5途径发挥对TRAIL的协同抗前列腺癌活性。