陈周明，李媛媛，陈青微

丽水市中心医院，浙江 丽水 323000

血虚肝郁证为肝血亏虚导致肝失疏泄调达，为肝失疏泄与肝血亏虚同时存在的复合中医证候。现代医学中肝脏能量代谢与物质内影响和中医学中肝藏血功能密切相关，肝脏能量代谢同时参与了神经-内分泌-免疫网络内免疫细胞因子和肽类激素等物质的存储及合成[1～2]。白芍性微寒、味苦，为中医传统的补血药，主要治疗气郁不舒和肝失调达等。白芍既可滋肝阴养肝血，又可敛肝阴柔肝体，是养血柔肝的代表性中药。芍药内酯苷和芍药苷是白芍的主要成分。研究显示，芍药苷有抗惊厥、抑制形成凝血酶原、抗氧化、抗血小板聚集及改善血液微循环等生物学效应，而芍药内酯苷和芍药苷的化学结构近似，为芍药苷同分异构体[3～4]。因此，本文通过观察芍药内酯苷和芍药苷对血虚肝郁证大鼠模型的影响，探究白芍“养血柔肝”功效物质基础与作用机制及血虚肝郁证证候实质。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取由浙江大学实验动物中心提供健康SPF级，雄性SD大鼠48只，6周龄，体质量(195.27±15.72)g，实验动物许可证号为：SCXK(浙)2007-0029，饲养大鼠室内温度23～26℃，湿度40%～60%，光照周期为光∶暗(12 h∶12 h)，适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药物、试剂及仪器 药物：芍药内酯苷(自制，含量高于98%)，芍药苷(自制，含量高于96%)。试剂：电泳缓冲液、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制剂、HRP标记山羊抗大鼠(武汉谷歌生物科技公司生产)。甘氨酸(美国Solarbio公司生产)。

仪器：封口机PF(温州江南机械厂生产，型号：PF-S-200)，紫外分光光度计(上海现科仪器公司生产，型号：752-P)，电泳仪(北京六一仪器厂，型号：DYY-6C)，台式离心机(上海安亭科学仪器厂生产，型号：TGL-16C)，磁力搅拌器(常州澳华仪器公司生产，型号：79-1)，灰度分析软件(美国Alpha Innotech公司生产，型号：alphaEaseFC)。

1.3 动物分组与模型制备 随机数字表法将大鼠分成对照组、模型组、芍药内酯苷组及芍药苷组4组，各12只。制备血虚肝郁大鼠模型。依据张建军等[5]的方法，除对照组外，其余各组大鼠采用束缚结合孤养，束缚操作：每天上午8点至11点束缚3 h，共束缚3周，束缚期间大鼠饮食和光照均正常进行，经过移动束缚筒中内底板位置无损伤将大鼠完全固定，大鼠掉头、进退限制，以不影响排泄、呼吸及不产生压迫感为度。在实验第8天时，使用60Coγ 射线对大鼠全身照射1次，照射距离为4 m，剂量率为191.55 Gy/h，照射剂量为3.5 Gy，照射后各组大鼠继续束缚结合单笼饲养2周。大鼠造模第1天开始给药，芍药内酯苷组灌胃30 mg/(kg·d)芍药内酯苷(等于2 g/kg白芍饮片)，芍药苷组灌胃30 mg/(kg·d)芍药苷(等于1.25 g/kg白芍饮片)，对照组和模型组灌胃等剂量生理盐水，共灌胃3周。

1.4 观察及检测指标 观察大鼠一般活动情况；灌胃3周后将大鼠断头处死，在冰上快速剥离海马，使用高效液相色谱-电化学检测系统检测海马内单胺类神经递质5-羟吲哚乙酸(5-hy-droxyindole acetic acid，5-HIAA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、肾上腺素(Epinephrine，E)、5- 羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(Dopaminem，DA)水平及大鼠大脑皮层内蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)水平，大鼠腹主动脉取血6 mL并在大鼠没有死亡前，快速断头冰上分离并摘取大脑皮层，液氮冷冻保存。用蛋白免疫印迹法检测大鼠海马内脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、磷酸化元件结合蛋白(P-cAMP-response element binding protein，P-CREB)及PKA蛋白表达状况。

1.5 统计学方法 使用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析和独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般活动情况 与对照组比较，模型组大鼠出现尾巴、耳朵慢慢变苍白，大部分时间懒动，反应迟钝，安静时拱背，眼眶取血时血色较暗红，食量降低等血虚症状，同时伴随对糖水和周边环境敏感性下降，毛发凌乱且色泽晦暗，灌胃时反抗较剧烈，警惕性高，喜欢蜷伏在角落等血虚肝郁表征；与模型组比较，芍药内酯苷和芍药苷组大鼠状态逐渐改善，眼睛、口唇颜色恢复正常，毛发整齐有光泽，活动度较好，对外界刺激较灵敏。

2.2 各组大鼠海马内单胺类神经递质和代谢产物水平比较见表1。与对照组比较，模型组大鼠海马内5-HIAA、NE、E、5-HT及DA水平均降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，芍药内酯苷组和芍药苷组大鼠海马内5-HIAA、NE、E、5-HT及DA水平均较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠大脑皮层内PKA、cAMP水平比较 见表2。与对照组比较，模型组大鼠大脑皮层内cAMP、PKA水平均下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，芍药内酯苷组和芍药苷组大鼠大脑皮层内cAMP、PKA水平均较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠海马内单胺类神经递质和代谢产物水平比较(±s) ng/g

表1 各组大鼠海马内单胺类神经递质和代谢产物水平比较(±s) ng/g

与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别对照组模型组芍药内酯苷组芍药苷组D A 110.49±10.8286.21± 10.94①107.58± 10.63②108.14± 10.51②n E 121212125-H IA A 27.47±3.3022.98± 3.28①26.09± 3.42②26.12± 3.54②N E 28.39±5.4021.09±5.32①26.08± 5.31②26.31± 5.68②29.63±5.9719.89±6.07①25.75± 6.04②26.26± 6.13②5-H T 42.37±6.0235.18± 5.81①40.29± 5.46②40.11± 5.65②

表2 各组大鼠大脑皮层内PKA、cAMP水平比较(±s)pmol/mg

表2 各组大鼠大脑皮层内PKA、cAMP水平比较(±s)pmol/mg

与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别对照组模型组芍药内酯苷组芍药苷组n 12121212 PK A 0.05±0.020.02± 0.01①0.04± 0.01②0.04± 0.01②cAMP 1.90±0.311.34± 0.25①1.84± 0.28②1.82± 0.24②

2.4 各组大鼠cAMP/PKA信号路径内相关蛋白表达比较 见表3。与对照组比较，模型组大鼠PKA、BDNF蛋白显著降低，P-CREB蛋白显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，芍药内酯苷组和芍药苷组大鼠PKA、BDNF蛋白显著升高，P-CREB蛋白显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠cAMP/PKA信号路径内相关蛋白表达比较(±s)ppm

表3 各组大鼠cAMP/PKA信号路径内相关蛋白表达比较(±s)ppm

与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别对照组模型组芍药内酯苷组芍药苷组n 12121212 PK A 8.02±0.311.95± 0.23①5.78± 0.27②6.23± 0.25②BD N F 4.02±0.492.25± 0.54①3.50± 0.52②3.56± 0.56②P-CREB 1.39±0.633.91± 0.72①1.64± 0.71②1.68± 0.69②

3 讨论

血虚肝郁证多见于月经不调、虚劳、胁痛及眩晕等妇科和内科疾病中[6～7]。辐照联合慢性束缚应激建立的血虚肝郁证候模型为经典中医证候模型，辐照状态下长时间束缚制动会导致大鼠的困境心理应激状况，在病因上模拟情志病患者前期情志不畅、所愿不遂，引起肝气郁结的发病特征[8]。肝藏血，体获得阴柔则能阳刚；肝疏泄，用能阳刚则体得阴柔，泄藏互用，相反相成。调肝以养护肝血，先要柔肝体，白芍可酸敛气机、阴柔养血，不仅能够安已乱之气机，还能够护肝脏之阴血，切中病机[9～11]。

单胺类神经递质为调节机体精神活动、行为状态和情绪的主要物质，包含5-HT和儿茶酚胺等，其中儿茶酚胺包含DA、E及NE等，研究显示，在抑郁症等精神疾病中单胺类神经递质对患者发病有重要影响[12～14]。本研究显示，芍药内酯苷组和芍药苷组大鼠5-HIAA、NE、E、5-HT及DA水平均高于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，说明芍药苷及芍药内酯苷都能够提升大鼠机体内单胺类神经递质含量，增强外周交感神经的兴奋性。大鼠cAMP/PKA信号路径内，G蛋白藕联受体能够结合很多神经递质，活化造成腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase，AC)活性上升，进而使cAMP含量升高来激活PKA，活化PKA可以使CREB发生磷酸化，转录因子活性得到调节，介导细胞发生对外界刺激反应[15～16]。BDNF可以加速神经元分化，保持神经元成长，修复神经元损伤。本研究显示，模型组大鼠海马组织内BDNF与PKA表达降低，在灌胃治疗后PKA和BDNF蛋白较模型组升高，说明模型组大鼠大脑皮层内PKA活性下降、cAMP水平降低，同时海马神经元细胞内BDNF和PKA蛋白表达降低，肝郁血虚大鼠脑组织的神经元内cAMP/PKA信号路径紊乱，并引发神经系统的病理变化，芍药苷与芍药内酯苷可激活PKA活性，使cAMP水平升高，上调BDNF与PKA蛋白表达量。

综上，芍药内酯苷和芍药苷可调节血虚肝郁大鼠神经递质含量，调控大鼠机体内cAMP/PKA信号路径内相关蛋白表达，从而起到保护神经作用，它们都是白芍养血柔肝的药效物质基础。