宫锦蕾，王美凤，邢国英，孙英华，夏海，王复超，张兆卿

(1潍坊医学院附属益都中心医院，山东潍坊262500；2大连医科大学附属第一医院)

骨肉瘤是一种高度恶性的原发性骨肿瘤，好发于青少年，早期易发生肺转移，5年生存率低[1,2]。15%～20 %的骨肉瘤患者在初诊时影像学已发现肺转移，约50 %的骨肉瘤患者在晚期治疗期间发生肺转移，最终发生肺转移的患者可高达80%[3]。近年来骨肉瘤在病因、发生发展机制、早期诊断和治疗方面取得了一定的进展，但在骨肉瘤发生、发展过程中起关键作用的基因尚不明确，临床上也缺乏有效的靶向治疗药物及分子生物学标志物。微小核糖核酸(miRNA)是一类高度保守的内源性非编码小RNA，参与调控众多关键的细胞通路及肿瘤的发生、发展过程[4,5]。但目前有关miR-495在骨肉瘤中的作用研究甚少,为此，我们进行了如下研究。

1 临床资料

选择2012年2月～2013年1月在潍坊医学院附属益都中心医院行手术治疗的骨肉瘤患者56例，男34例、女22例，年龄>20岁16例、≤20岁40例，肿瘤部位在四肢49例、其他7例。排除合并严重心脑血管疾病、肝肾功能不全及其他肿瘤患者。患者术前均未行放化疗及生物免疫治疗。56例均经术后病理检查确诊为骨肉瘤，肿瘤直径>5 cm 40例、≤5 cm 16例，Enneking分期Ⅰ～Ⅱa期14例、Ⅱb～Ⅲ期42例，淋巴结远处转移18例、无远处转移38例。本研究通过医院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情同意。

2 方法与结果

2.1 骨肉瘤组织及其癌旁组织miR-495表达检测 收集患者术中切除的骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织(距离肿瘤边缘>5 cm，病理检查证实为正常组织)标本各56例份，取材后迅速置入液氮中，-70 ℃保存，采用real-time PCR法检测miR-495表达。具体方法：取液氮中保存的骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织，研磨后采用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取组织总RNA，分光光度仪检测总RNA的纯度及浓度，以OD260/OD280为1.9～2.0作为合格标准。按逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明书将RNA逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，参照实时荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明书配置real-time PCR体系进行PCR反应。miR-495引物序列：上游引物为5′-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6引物序列：上游引物为5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-495相对表达量。结果显示，骨肉瘤组织及其癌旁组织miR-495相对表达量分别为0.42±0.16、1.01±0.05，两者比较P<0.01。骨肉瘤组织miR-495相对表达量的均值为0.42。56例患者中，miR-495相对表达量≤0.42者31例、>0.42者25例。

2.2 骨肉瘤组织miR-495表达与患者临床病理参数及预后的关系 收集患者的临床资料，包括性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、Enneking分期、淋巴结远处转移等。对所有患者进行随访，采用门诊或者住院复查及电话随访的方式进行，以手术出院当日作为随访起点。总生存期定义为从随访起点开始到死亡日期或最终观察日期2018年1月，失访及其他原因导致的死亡按截尾数据处理，计算5年生存率。分析miR-495表达≤均值与患者临床病理参数及预后的关系。

结果显示，骨肉瘤组织miR-495表达≤0.42与患者Enneking分期、淋巴结远处转移有关(P均<0.01)，与患者性别、年龄、肿瘤直径及肿瘤部位均无关(P均>0.05)。见表1。

表1 骨肉瘤组织miR-495表达≤0.42与患者临床病理参数的关系(例)

骨肉瘤组织miR-495表达≤0.42者5年生存率为26%，>0.42者5年生存率为48%；二者比较P<0.01。见图1。COX比例风险回归模型结果显示，miR-495表达≤0.42是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素(HR=3.699，95%CI：1.985～6.941，P<0.05)。

图1 miR-495表达与骨肉瘤患者生存期的关系

3 讨论

病理学分期是预测骨肉瘤生物学行为及患者预后的传统手段，但其存在明显的局限性。目前临床急需寻找有效而准确的早期诊断及判断预后的骨肉瘤分子生物学标志物。研究证实，基因表达异常与肿瘤的发生、发展密切相关[6]，异常表达的基因有可能成为恶性肿瘤有效而准确的分子生物学标志物[7,8]。miRNA是近年来发现的一类长度为20～25个核苷酸非编码小分子RNA，虽然miRNA仅占人体基因总数的2%，但却参与调控人体30%以上的基因表达[9,10]。研究发现，多种miRNA参与调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等恶性生物学行为，从而参与骨肉瘤的发生、发展过程[11]。Li等[12]研究发现，miR-34a、miR-143、miR-145、miR-200b在骨肉瘤细胞中的表达均降低，并与骨肉瘤的侵袭与转移有关。Wang等[13]报道，与正常骨组织比较，骨肉瘤组织中miR-214表达明显增高，并且高表达的miR-214与肿瘤远处转移及化疗耐药有关。miR-495是近期发现的miRNA家族重要成员之一。研究发现，miR-495在食管癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中表达降低[14～16]，而在肝细胞癌、乳腺癌等恶性肿瘤中表达升高[17,18]，提示miR-495存在组织和细胞的特异性，在不同的肿瘤中可能发挥不同作用。

目前有关miR-495在骨肉瘤组织中表达变化的研究甚少。本研究结果显示，骨肉瘤组织miR-495相对表达量明显低于癌旁组织，提示miR-495表达异常下调可能参与了骨肉瘤的发生。本研究结果显示，骨肉瘤组织miR-495相对表达量≤0.42与患者Enneking分期、淋巴结远处转移有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径及肿瘤部位均无关；说明miR-495异常低表达可能参与了骨肉瘤的转移过程。miRNA的功能主要取决于其下游靶基因的生物学效应，目前miR-495调控骨肉瘤发展转移的具体下游分子机制尚不完全清楚。Zhang等[19]研究证实，miR-495通过负调控下游靶基因MYB表达而抑制胶质瘤瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。Chu等[20]研究发现，miR-495通过靶向调控MTA3基因而抑制非小细胞肺癌细胞的增殖及转移。但miR-495在骨肉瘤中的下游调控靶基因尚有待进一步探讨。

目前有关miR-495对恶性肿瘤患者预后影响的研究较少。Wang等[21]在对62例髓母细胞瘤患者的随访研究中发现，miR-495低表达与髓母细胞瘤患者的不良预后密切相关。也有研究发现，非小细胞肺癌组织中miR-495表达与患者预后无关[22]。目前尚未见miR-495对骨肉瘤患者预后影响的报道。本研究结果显示，骨肉瘤组织miR-495表达≤0.42者5年生存率低于miR-495表达>0.42者，miR-495表达≤0.42是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素；说明骨肉瘤组织miR-495表达≤0.42提示患者预后较差。

综上所述，骨肉瘤组织中miR-495表达降低，miR-495异常低表达可能参与了骨肉瘤的发生、发展及转移，并且与患者预后不良有关。miR-495有望成为骨肉瘤早期诊断及判断预后的分子生物学标志物，但其在骨肉瘤中的具体作用机制尚有待进一步研究。