李娇洋,杨 帆,包 斌,*

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台,上海 201306；3.内蒙古鄂尔多斯市生态环境职业学院,内蒙古鄂尔多斯 014300)

叶类蔬菜(以下简称叶菜),是指以菜叶和叶柄为食用部分的蔬菜。主要包括白菜类(大白菜、结球甘蓝),绿叶菜类(菠菜、芹菜、油菜、香菜(芫荽)、生菜、空心菜(蕹菜)、木耳菜、荠菜、苋菜、茼蒿、乌塌菜、茴香)和葱韭类(韭菜、蒜苗,芽菜类中的豌豆苗、菊苣芽、荞麦芽、萝卜芽、佛手瓜嫩梢)等21种叶类蔬菜[1]。根据中国农业部“2016年我国蔬菜交易市场发展态势分析”项目组对全国77个大中城市(城镇常住人口过百万)生产情况调查的不完全统计,2005～2012年蔬菜产量增加了27.0%。预计到2020年,我国蔬菜人均占有量每年400 kg,将成为世界蔬菜第一生产大国[1]。由于我国蔬菜产业链不完善,大部分地区仍采用直销或是初加工的方式,导致我国蔬菜腐烂率极高,在运输和销售过程中,造成大量的浪费。故对叶菜的贮藏手段进行研究是不可或缺的。

叶菜采后已不能再从土壤中获取养分,但仍进行着一系列复杂的生命活动,导致叶菜品质发生不同程度的改变,而对这些变化的评价是选择贮藏方法的重要依据。本文在概述叶菜贮藏期间生理和营养成分变化的基础上,着重总结了反映以上变化的指标及其析方法。

1 叶类蔬菜贮藏中的品质变化的评价指标

1.1 生理变化的评价指标

蒸腾作用是果蔬表面失水的重要原因,水分通过果蔬表皮的角质层、皮孔和气孔散发出去[2]。当水分散失超过果蔬重量5%时,果蔬就会出现萎蔫,并且失水还会影响正常的呼吸作用,使水解酶活力增强,糖酸类物质的水解加速,加快了果蔬成熟和衰老的过程[2]。通过失重率可以直观明了地评价叶菜在贮藏期间的蒸腾作用强弱(失水情况)。大部分的叶菜贮藏研究中,失重率均会作为评价指标之一,监测叶菜在贮藏过程中的失水情况。金文斌等[3]用乳酸钙对鲜切菠菜进行处理,采用浓度为0.75%(最佳处理浓度)的乳酸钙处理,在贮藏终点(第12 d)时,处理组的失重率显著低于对照组(p<0.05),说明乳酸钙能够有效减缓鲜切菠菜在冷藏过程中的蒸腾作用。

呼吸作用是采后叶菜一个最基本的生理过程。叶菜采后,同化作用基本停止,呼吸作用成为新陈代谢的主导。呼吸作用直接、间接地联系着各种生理生化过程,因此也影响着叶菜的耐贮性。呼吸作用越旺盛,各种过程变化越快,生命终止也就越早[2]。呼吸强度(用CO2的生成量表示)和乙烯释放量是评价呼吸作用的两个指标。周伟[4]对低温下单色LED和短波UV(UV-C)照射对上海青贮藏品质调控进行了研究,对贮藏期间乙烯释放量和呼吸强度分别进行了探讨,结果显示,在呼吸骤变期(第4 d),红色LED和UV-C处理组的呼吸强度和乙烯释放量显著低于对照组(p<0.05)。

与此同时,贮藏期间叶菜中许多酶的活性也会发生变化,包括叶绿素酶、组织纤维素酶、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine lyase,PAL)。其中PAL是植物中催化苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶,蔬菜采收时不可避免会造成机械损伤,此时PAL被诱导,促进多酚化合物的下游生物合成[5]。研究表明[6],当蔬菜受到外界环境的干扰,如寒冷、机械损伤、紫外辐射等,体内生理代谢中苯丙烷类代谢被激活,PAL活性会迅速上升,故采后蔬菜PAL活性会随着贮藏时间的延长而升高。PPO与酚类化合物的相互作用是导致蔬菜褐变的生物化学反应途径的原因,PPO与多酚类物质接触,催化多酚类物质氧化成邻醌,再进一步氧化聚合成黑色素,最终导致色泽劣变[5]。Viacava等[7]采用天然化合物壳聚糖和茶树精油分别对莴苣进行处理后在低温(0～2 ℃)条件下进行品质评估,结果显示,壳聚糖和茶树精油在贮藏期间均能抑制PPO和POD活性的上升,壳聚糖的效果更佳,在贮藏终点(第21 d)时,壳聚糖处理组的PPO和POD活性显著(p<0.05)低于对照组。张艳芬[8]在低温贮藏期间荠菜品质和生理特性变化的研究中,以叶绿素酶、纤维素酶、SOD、PAL、POD的活性作为检测指标,结果显示,在0 ℃时,随着贮藏时间的延长,叶绿素酶和纤维素酶的活性均呈先增长后下降的趋势,SOD活性呈下降趋势,PAL、POD活性呈上升趋势,而PPO活性极弱,贮藏期间并无明显变化。

电导率是电解质由植物体释放到水中的速度决定的,而电解质的释放与细胞膜结构和透性的改变息息相关。随着贮藏时间的延长,蔬菜受病原菌污染的可能性增大,细胞膜的通透性增加,电解质溶出更多,电导率呈上升趋势。王颖荣等[9]研究了低温对自发气调包装鸡毛菜保鲜效果的影响,分别在0、4、8、12 ℃下贮藏,并测定了电导率的变化,在贮藏终点(第14 d)时,0、4 ℃的电导率仅为7%,另外两组为12%。

1.2 营养品质变化的评价指标

由于采后叶菜不再从土壤等外界获取能量,随着采后呼吸作用的进行,叶菜营养物质发生了变化。其中叶绿素、维生素C、还原糖、酚类、可滴定酸等会随着贮藏时间的增加而减少,导致叶菜出现褪绿、酸度增加等“亚健康”的状态。因此叶绿素、维生素C、还原糖、酚类、可滴定酸度可以作为叶类蔬菜营养物质变化的评价指标。Ubeed等[10]研究了硫化氢熏蒸对采后白菜品质的影响,测定了叶绿素、维生素C等指标。

1.3 其他品质变化的评价指标

除了生理变化和营养品质变化外,叶菜在贮藏中亚硝酸盐[11]、菌落总数[12]、感官[13]以及色泽[14]方面也会发生明显变化。随着贮藏时间的延长,菌落总数和亚硝酸盐的含量逐渐上升,感官评定的分数逐渐下降,色泽逐渐趋于黄褐色。

2 叶类蔬菜贮藏中品质变化评价指标的分析方法

2.1 生理变化指标的分析方法

2.1.1 失重率 失重率指叶菜贮藏后与贮藏前的质量差与贮藏前质量的比值,乘以100,从而得到一个表示质量变化的数值[15]。

2.1.2 呼吸强度和乙烯 测定呼吸强度的方法主要是静置法[4,16]、气流法[17]、气相色谱法[18]以及红外线CO2分析仪法[19-21]。静置法和气流法的原理相同,用定量碱液吸收蔬菜在一定时间内呼吸所释放出来的CO2,再用酸滴定剩余的碱,即可计算出呼吸所释放出CO2量,求出其呼吸强度，以每公斤每小时释放出来的CO2毫克数表示。相对气流法来说,静置法操作简便、成本低,但耗时长、误差较大,而气流法操作稍显繁琐,但可以连续多次测定。红外线CO2分析仪法是操作最为简便的一种方法,故适于样品量大,检测次数多的样品中,但该方法不能得到一定时间内一定量蔬菜呼吸所产生CO2量的具体数值,只能得到CO2的百分含量,可以用于在贮藏期间监测叶菜呼吸强度的变化。张桂[22]比较了静置碱液吸收法和CO2分析仪法两种方法测定果蔬呼吸强度的不同,结果显示:静置碱液吸收法测定果蔬的采后呼吸强度简便,易行,仪器简单,成本低,测定数据可以满足需要的精确度;CO2分析仪测定法测定数据精确、可靠,快速,仪器使用方便。当置信度为95%时,平均值的置信区间要比静置碱液吸收法小,从而可以证明其测定的准确度高于静置碱液吸收法。

测定乙烯释放量的方法主要是气相色谱法[16,23]。及雪良等[23]用气相色谱法测定莴苣在贮藏期间的乙烯释放量,使用Agilent 6890N型气相色谱仪,氢离子火焰检测器(Hydrogen ion flame detector,FID),色谱条件为柱温45 ℃,色谱柱HP-5 Phenyl Methyl Siloxane,检测器温度250 ℃,燃气H2流速40 mL/min,助燃空气流速450 mL/min,载气N2流速45 mL/min,不分流进样,保留时间5 min,进样量0.1 mL。

2.1.3 电导率 电导率的测定主要是采用电导率仪法[3,10]。电导率仪由振荡器、电导池、放大器、指示器等部分组成,电极是电导率仪的重要组件,分为铂黑电极和光亮电极,通常铂黑电极用的比较多,它的表面积比较大,降低了电流密度,减少或消除了极化。但在测量低电导率溶液时,铂黑对电解质有强烈的吸附作用,出现了不稳定的现象,这时宜用光亮电极[24]。

2.1.4 酶活 叶菜贮藏中活性发生变化的几种酶的分析方法见表1。

表1 叶菜贮藏中酶活的分析方法

2.1.4.1 叶绿素酶 测定叶绿素酶活性的方法主要是紫外分光光度法。酶的提取条件和活性分析条件是测定时的主要影响因素。顾炜[44]在茶树叶绿素酶的分离纯化和性质的初步研究中,对叶绿素酶提取条件和活性分析条件进行了优化研究,结果显示:当聚乙烯吡咯烷酮加入量与样品鲜重一致、缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、提取液pH为7.5时为最佳提取条件;最佳活性分析条件为反应温度40 ℃、反应时间15 min。

2.1.4.2 纤维素酶 测量纤维素酶活性的方法主要是羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC)糖化法和己糖激酶法。CMC糖化法适用于实验室操作,而己糖激酶法适用于自动化(即在大型生化分析仪上测定)。孙盈等[27]研究和分析了羧甲基纤维素酶活性测定法的实验条件,结果显示,纤维素酶活力测定的最佳条件为:在酶促反应温度为40 ℃,pH6.2,底物浓度为10 g/L,粗酶液和底物添加量均为2 mL,酶促反应时间30 min,测定波长520 nm。

2.1.4.3 超氧化物歧化酶(SOD) 检测SOD活性的方法主要有氮蓝四唑(Nitrogen blue tetrazole,NBT)光化还原法和邻苯三酚法。邻苯三酚法又称作420 nm法,有较多的改良方法,例如325 nm法[45]、微量邻苯三酚/维生素C终止剂法[46]、DTT终止剂法[47]等。近几年来,NBT光化还原法得到了充分的发展,同传统的比色法相比,化学发光法专一性较强、干扰因素少、灵敏度高,最适用于粗提取液中SOD活性的检测[48]。曲敏等[49]对NBT光化还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性分别从灵敏度、精确度、重现性三个方面进行了比较,在标准品SOD酶活的测定中,邻苯三酚自氧化法的精确度高于NBT光还原法,但灵敏度远不及后者。在测定两种植物(苜蓿草和番茄)SOD时,NBT光还原法具有稳定性、重现性好的特点,优于邻苯三酚自氧化法。故NBT光还原法是测定植物SOD及SOD标准品酶活的理想检测方法。

2.1.4.4 多酚氧化酶(PPO) 检测PPO活性的方法主要有邻苯二酚法和氧电极法。其中邻苯二酚法使用更为广泛,针对不同的样品采用不同的邻苯二酚改良法。冯佳丽等[35]以南烛叶为原料分别研究了交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)添加量、料液比、浸提时间和pH各因素对提取的PPO酶活的影响。结果显示最佳条件为:9%的PVPP,料液比1∶15 g/mL,pH为7.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.1 mol/L),4 ℃下浸提9 h,得到的最高酶活为11335 U/mL。也有研究表明[50]植物组织中SOD、POD活性受提取缓冲液pH影响,常用的缓冲液pH为6.0、7.0、7.8、5.5,SOD不适合在低pH6.0提取缓冲液下提取,POD不适合在pH7.0的提取缓冲液下提取,但二者均可在pH7.8的缓冲液中提取。

2.1.4.5 过氧化物酶(POD) 检测POD活性的方法主要有愈创木酚法和邻苯三酚自氧化法。二者操作难易程度相当,但愈创木酚法比邻苯三酚法更加灵敏,故愈创木酚法是最常用的方法。刘扬[51]对养心菜POD活性的测定时间、pH、温度进行了比较,结果表明:养心菜POD酶活测定时间应选择0～3 min内吸光度的变化,养心菜POD最适pH为5.5,最适反应温度为50 ℃。

2.1.4.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL) 检测苯丙氨酸解氨酶的方法主要是聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)法,采用硫酸铵做沉淀剂。曹锦萍等[52]研究了硫酸铵一次沉淀法和分级沉淀法对苯丙氨酸解氨酶活性测定的影响,结果显示,一次沉淀法产率高,产率越高则活性越高,而分级沉淀法产率较低,但可去除大部分的杂蛋白,且纯化倍数高。

2.2 营养成分的分析方法

叶菜贮藏中各种营养成分的分析方法见表2。

表2 叶菜贮藏中营养成分的分析方法

2.2.1 叶绿素 叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法。目前应用最为广泛的是紫外分光光度法。研究者对提取剂的优化选择也是常见的研究之一。任红等[71]对5种提取剂提取菜心叶绿素进行了研究,分别是95%乙醇、80%丙酮、丙酮∶乙醇=1∶1、丙酮∶乙醇=1∶2和丙酮∶乙醇=2∶1,结果显示,乙醇法提取时间长,对木本植物提取效果差;丙酮法提取液中叶绿素易受光氧化破坏,使测定值偏低,故不适合用于测量数量多的样品;混合液提取法中,丙酮∶乙醇=2∶1提取法的叶绿素的提取率和提取液的稳定性最佳,可以快速测定大批量样品的叶绿素含量。

2.2.2 维生素C 维生素C含量测定方法主要有高效液相色谱法、荧光分析法、2,6-二氯靛酚滴定法。其中2,6-二氯靛酚滴定法对操作人员要求较高,当样品颜色较深时,会影响对滴定终点的判断。于玲等[72]分别采用紫外可见分光光度法、荧光法和高效液相色谱法对7个不同产区酸枣仁中的维生素C含量进行了测定,结果显示,三种方法的测定结果差异不大,但高效液相色谱法较其他两种方法精密度高,准确性好,操作步骤简单。郑清岭等[63]采用不同的方法对沙芥属蔬菜(沙芥和斧形沙芥)植物维生素C的含量进行了测定,结果显示:滴定法和荧光法的回收率无明显差异,但荧光法比滴定法的精确度高,因此,荧光法比滴定法更佳。Santosa等[73]将超声波提取与LC-MS/MS和LC-DAD相结合,以量化薄荷、菠菜等12种鲜切蔬菜中的游离维生素含量。

2.2.3 还原糖 还原糖含量测定方法主要有GB/T 5000.7-2008[74]中规定的直接滴定法、3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)和铁氰化钾-三氯化铁光度法。直接滴定法适用性强,但操作繁琐,对滴定终点判断困难,容易存在人为误差。3,5-二硝基水杨酸比色法是半微量定糖法,操作简便、快捷,杂质干扰较少,适合批量测定,是目前实验室测定还原糖最常用的方法。李志霞等[75]用响应面法对3,5-二硝基水杨酸比色法测定水果中还原糖含量条件进行了优化,结果显示,影响DNS法测定还原糖含量的因素主次顺序为:DNS用量>反应温度>显色时间。DNS法测定还原糖含量的最佳条件为:DNS用量4.0 mL,显色时间5.0 min,反应温度87.0 ℃。

2.2.4 可滴定酸 可滴定酸含量测定方法主要是酸碱滴定法。可滴定酸易溶于水和乙醇,浸出液呈酸性,可用氢氧化钠标准溶液滴定,以酚酞为指示剂,通过消耗的氢氧化钠体积计算出可滴定酸的含量。

2.2.5 酚类物质 测定酚类物质含量的方法有比色法(亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠为显色剂)和高效液相色谱法。比色法可以测定样品中的总酚含量,高效液相色谱法可同时测量多个酚类物质,且分离度较好。操作简便、精确,色谱条件[76]为:流动相:甲醇和4%醋酸(27∶73),柱温40 ℃,流速0.8 mL/min,紫外检测器波长313 nm。

2.3 其他指标的分析方法

2.3.1 菌落总数 测量菌落总数的方法主要有平板菌落计数法[77-78]、菌落总数测试片法[79]和TTC琼脂培养基检测法[80]。李光泽[81]对食品微生物检验菌落总数测定方法的效果进行了比较分析,结果显示,与测试片及平板技术法相比,TTC法对于菌落总数超标样品的检出率更高、灵敏度更好。

2.3.2 亚硝酸盐 测定亚硝酸盐含量的方法很多,主要有以下几大类:Griess试剂比色法[82]、酚二磺酸比色法[83]、高效液相色谱法[84]、离子色谱法[85]和毛细管电泳法[86]等。毛细管电泳法由于其设备普及性强,高灵敏度和选择性,低检测限[87],而备受国内外很多研究者的青睐。

2.3.3 感官评定 感官评定是通过主观评判的一个指标,对于不同的叶菜,评定的细则有一定差异,通常包括颜色、气味、形态、质地等。感官评定[88-89]也被作为叶菜贮藏期间一个和商业价值关系最密切的指标。

2.3.4 色泽 色泽除在感官评定中被评价外,最常用的客观评价方法是色差仪法[90]。在植物花、叶等测色研究中通常采用基于色空间(Color space)的仪器测色法,即利用色差仪在自带特定光源条件下测量色差指标值,但是由于测色仪镜口与茶树叶片大小之间的不对等性,使得在实际操作过程中会出现由于叶面积太小导致近似漏光、单叶多点重复测色难以实现等诸多不足。孔祥瑞等[91]使用扫描仪、Color Pix等组件构成的测色装置,却可以避免上述缺点,这对于特异叶色或花斑叶色材料的鉴定,以及观赏性植物的花色测定、果蔬类叶病监测等均具有实际应用价值。

3 总结与展望

国内外对叶菜的贮藏研究越来越重视,贮藏方法的效果需要通过品质变化评价指标进行分析。传统的贮藏手段已经不能满足人们对叶菜贮藏过程中保持色、香、味等方面的需求,故随着保鲜手段的日益丰富,贮藏过程中生理变化和营养品质变化的评价显得尤为重要。本文综述了叶菜贮藏过程中品质变化评价指标及其分析方法。为叶菜保鲜向着越来越好的方向发展提供参考。同时,叶菜贮藏期间,若能利用新方法和新技术同时测定多个指标,则效率将会大幅提高,因此可把多指标同时检测作为未来指标分析方法的研究方向。