裘迪红,黄丽华,陈哲科,王妮妮,戴 苡,钟要红

(杭州医学院,浙江杭州 310053)

目前,慢性病已经是全球人类健康的重大问题,动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管疾病已严重威胁着人类的健康,血清中高胆固醇含量是引起众多心血管疾病的重要因素之一,甚至成为导致死亡的首要因素[1]。目前虽然有许多用于降低胆固醇的药物,但人们更希望能够通过非药物途径来达到降低胆固醇含量的目的。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属,是人体胃肠道的土著菌群,植物乳杆菌具有维持肠道内菌群平衡[2]、降低胆固醇水平[3]、提高机体免疫力、促进营养物质吸收[4]等多种功能。利用益生菌降低食品和人体血清中的胆固醇,是近20年来随着人们对营养与健康要求的逐渐提高才发展起来的一项新的研究课题,其应用价值也正被越来越多的研究者和企业所看好。因此,国内外学者对植物乳杆菌的分离鉴定及其益生特性进行了大量的研究,植物乳杆菌降低血清中胆固醇的益生特性尤其引人注目,Jeun等研究了植物乳杆菌的降血脂功能,Lye等研究植物乳杆菌的降血脂功能及其机理,Jafari等研究了植物乳杆菌发酵乳的降胆固醇效果[5-7]。冉冉在藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂对大鼠降胆固醇的研究中发现植物乳杆菌对大鼠血清胆固醇有显著的降低作用[8],王俊国在植物乳杆菌LIP-1对高脂血症大鼠血脂的调节作用的研究中也发现植物乳杆菌有降血脂的功能[9]。更多的研究者开始关注植物乳杆菌产品的开发以及机理的研究。目前,国内市场尚未出现以降胆固醇功能为主的功能性发酵乳,因此开发降胆固醇发酵乳,对高脂血症的人群进行营养干预,以期达到降低血脂、预防心血管疾病的目的,是预防慢性病的一条途径。

本实验从从泡菜中分离出一株体外胆固醇降解率为45%的植物乳杆菌,经过牛乳发酵的风味研究发现,该菌在牛乳培养基中能产生独特的风味,因此把该菌应用到降胆固醇发酵乳的制备中。为缩短发酵时间,采用混合乳酸菌发酵制备发酵乳,为了解其降血脂功能,采用高血脂模型小鼠研究发酵乳在体内的降血脂功能,以期为将来降胆固醇乳制品的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛乳 蒙牛牌,购于超市;菌种 植物乳杆菌,实验室分离鉴定获得;商业发酵剂(嗜酸链球菌、保加利亚乳杆菌) 北京川修科技有限公司;昆明雄性小鼠 6周龄,体重38～44 g,许可证号SCXK(沪)2012-0002,上海斯莱克实验动物有限责任公司;动物房条件 温度(20±2) ℃,湿度78.5%,每天12 h光照,12 h黑暗;基础饲料配方(W/W):面粉20%,米粉10%,玉米20%,麸皮25%,豆料20%,骨粉2%,鱼粉;高脂饲料配方(W/W):基础饲料83.8%,胆固醇1%,猪油10%,牛胆盐0.2%,蛋黄5%;MRS肉汤培养基 航景生物科技有限公司。

总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量试剂盒 德赛诊断系统(上海)有限公司;0500790S日立7020全自动生化分析仪 上海曼普生物科技有限公司。PL4002电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;H-205R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;QHZ-12A组合式恒温振荡培养箱 上海泸西分析仪器厂有限公司;HWS恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂;LDZX-50KB立式高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;紫外分光光度计、FE20实验室PH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DK-8D型电热恒温水浴锅 上海一恒温科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 植物乳杆菌发酵液的制备 取 0.4 mL活化的植物乳杆菌于10 mL MRS肉汤培养基中,37 ℃摇床培养至菌体浓度约为107～108cfu/mL。

1.2.2 发酵乳的制备 混合菌发酵:新鲜牛乳预热到70 ℃,于40 MPa下均质,95 ℃杀菌5 min冷却至37 ℃,按比例加入植物乳杆菌和商业发酵剂发酵,植物乳杆菌添加比例为2%(v/v),商业发酵剂的添加量为0.05%(v/v),37 ℃静止培养,14 h后停止发酵,测定发酵乳的pH,同时用选择培养基测定植物乳杆菌活菌数。

1.2.3 高脂模型的建立和灌胃方法 动物分组和饲喂安排:小鼠自由饮水,基础饲料饲喂一周后,按体重和TC平均分配原则将小鼠分成正常组、对照组和发酵乳组3 组,每组10 只。不同处理组喂食情况分别为:正常组:喂基础饲料,每天每只灌胃0.4 mL生理盐水;对照组:喂高脂饲料,每天每只灌胃0.4 mL生理盐水;发酵乳组:喂高脂饲料,每天每只灌胃0.4 mL自制发酵乳。其中,正常组和对照组小鼠饲养14 d 后采血,检测TC、TG,评价是否形成高脂血症。小鼠饲养期间,每天保持充足的食物和饮水,期间每天记录小鼠的体重和摄食量。

1.2.4 实验动物的处理与检测方法

1.2.4.1 体重、摄食量和饲料利用率的测定 小鼠饲养期间,每天定时称量摄食量并记录,每周称一次体重,计算饲料利用率:饲料利用率(%)=体重/摄入量×100。

1.2.4.2 血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的测定 小鼠饲养28 d禁食12 h,眼眶静脉丛采血,4 ℃冰箱静置3 h,离心(3000 r/min,15 min,4 ℃),取血清,试剂盒测定小鼠血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

1.2.4.3 脏器指数的测定 末次灌胃24 h后,称量体重,立即摘取心脏、肝脏、脾脏和肾脏,生理盐水冲洗,滤纸吸干后称重,与小鼠最终体质量的比值即为脏器指数。

1.2.4.4 肝脏TC、TG含量的测定 把肝脏0.5 g加入5 mL甲醇-氯仿(V/V=2∶1)进行研磨,用甲醇氯仿(2∶1)混合液收集,定容至10 mL后于45 ℃水浴1 h,于4 ℃离心(8000×g,10 min),取30 μL上清液,用试剂盒测定TC和TG含量。

1.2.4.5 安全性评价 小鼠采血处死后,无菌操作取出肝脏,称重后,转移到灭菌培养皿,4 ℃冷藏,30 min内测定肝脏组织中是否有乳酸菌。具体方法:无菌条件切取肝脏2 g,灭菌PBS缓冲溶液(pH6.8)悬浮,均质机均质,溶液涂布MRS平板,37 ℃厌氧培养72 h,观察平板有无菌落。

2 结果与分析

2.1 发酵乳的制备

由于植物乳杆菌是营养缺陷型菌株,在牛乳中发酵能力差[10],而商业发酵剂的主要菌株是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,具有较强的发酵能力,所以本实验选择混合发酵的方法,在传统的发酵乳发酵过程中添加植物乳杆菌进行协同发酵,以此来提高植物乳杆菌的发酵能力。按植物乳杆菌添加比例为2%,商业发酵剂的添加量为0.05%,加入商业发酵剂和植物乳杆菌,37 ℃培养14 h后,所得发酵乳口感细腻,组织均匀,有酸奶独特的风味,发酵乳中的植物乳杆菌的活菌数为106cfu/mL。

2.2 发酵乳对高脂血症小鼠的影响

2.2.1 小鼠的高脂血症模型的建立 如表1所示,在实验14 d后,与正常组相比,对照组小鼠血清中TC、TG显著升高(p<0.05),表明高脂模型诱导成功。

表1 正常组、对照组小鼠血清中的TC、TG含量

2.2.2 发酵乳对高脂小鼠的体重、摄食量、饲料利用率及脏器指数的影响 在整个喂养期间,三组小鼠毛色光洁,食欲正常,均未出现异常体征,未发生自然死亡。由表2和表3可知,发酵乳组小鼠的体重、摄食量、饲料利用率和脏器指数与正常组相比,无显著差异(p>0.05),说明植物乳杆菌对小鼠没有毒副作用。对照组的体重、摄食量和饲料利用率比其它两组显著增高(p<0.05)。这进一步说明了本实验高脂模型建立成功。

表2 不同处理组小鼠的体重、摄食量和饲料利用率

表3 不同处理组小鼠的脏器指数(%)

2.2.3 发酵乳对高脂小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影响 从表4中可以看出,28 d喂养后,与对照组相比,发酵乳组小鼠血清中TC和TG含量显著下降(p<0.05),分别降低了43.21%和40.31%,而LDL-C和HDL-C无显著变化(p>0.05)。邹华军在发酵泡菜对高脂血症大鼠的干预效果研究中也有类似的结论[11],但是二者降低程度不同。王俊国在植物乳杆菌LIP-1对高脂血症大鼠血脂的调节作用中也发现植物乳杆菌有降血脂的功能,与本文不同之处是其LDL-C降低显著(p<0.05),HDL-C升高显著(p<0.05)。分析原因主要是植物乳杆菌降胆固醇的效果受很多因素的影响,在发酵乳中的植物乳杆菌与在脱脂乳中的植物乳杆菌由于培养基不同,降血脂的程度也会不同。

表4 不同处理组小鼠血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量(mmol/L)

2.2.4 发酵乳对高脂小鼠肝脏TC、TG 含量的影响 由表5可看出,实验28 d后,与正常组相比,对照组肝脏的TC、TG显著增加(p<0.05),与对照组相比,灌胃发酵乳组小鼠肝脏中TC、TG显著下降(p<0.05),分别下降了48.95%和31.54%。这说明了饲喂植物乳杆菌发酵乳可以显著减少胆固醇在高脂小鼠肝脏中的积存(p<0.05)。但是饲喂植物乳杆菌发酵乳的高脂小鼠中TC和TG含量仍明显高于正常组(p<0.05),表明灌胃植物乳杆菌仍不能使高脂小鼠恢复到正常状态。

表5 不同处理组小鼠肝脏中的TC和TG含量(mg/g)

2.2.5 肝脏的乳酸菌检测 对实验小鼠肝脏的乳酸菌检测显示,MRS平板上未发现乳酸菌菌落的形成,说明发酵乳在小鼠体内不会发生肝肠易位现象。

3 讨论与结论

目前,许多国内外研究者对乳酸菌降低胆固醇的影响因素和机理进行了研究,观点主要集中在以下3点:a. 乳酸菌菌体细胞能够同化吸收胆固醇:体外研究表明,在厌氧的条件下,乳酸菌在含有胆盐的高胆固醇培养基中生长时,菌体细胞可以同化吸收介质中的胆固醇,降低介质中胆固醇的含量。Grill[12]等发现在含有牛胆盐的高胆固醇培养基中,厌氧条件下,食淀粉乳杆菌细胞具有较强的胆固醇同化能力,可以降低培养基中约50%的胆固醇。b. 乳酸菌降解结合态胆酸转变为游离态胆酸,后者由于溶解度下降与胆固醇发生共沉淀反应,从而降低胆固醇含量。Klaver[13]等研究者认为,乳酸菌对胆固醇的降低作用是因为在酸性条件(pH<6.0)下,胆固醇与胆盐形成了沉淀,从而降低了培养基中胆固醇的含量。人体内存在脱结合胆酸与胆固醇共沉淀现象,这一作用将阻止胆固醇进入血液循环,避免了血清中高胆固醇的出现。c. 其他理论。对双歧杆菌的研究还发现,双歧杆菌通过抑制人体内活化的T细胞,控制新形成的低密度脂蛋白LDL受体,有助于降低血清胆固醇水平[14]。植物乳杆菌降胆固醇的作用机理是复杂的,反映出来的降胆固醇的效果也是不一样的。只有了解植物乳杆菌降胆固醇机理,才能最大程度地降低血清中的胆固醇。

本实验利用从泡菜中分离的植物乳杆菌制备发酵乳,发酵剂与植物乳杆菌接种量分别为0.05%(V/V)和2%(V/V),发酵温度为37 ℃,时间14 h,发酵乳具有清香、口感好的特点。经动物实验发现发酵乳对高脂小鼠具有一定的降胆固醇效果,高脂小鼠血清中TC和TG含量显著下降(p<0.05),而LDL-C和HDL-C含量无显著变化(p>0.05)。发酵乳在小鼠体内不会发生肝肠易位现象。为了增强发酵乳对高脂小鼠的降胆固醇能力,提高植物乳杆菌的发酵能力,植物乳杆菌的代谢、降胆固醇机理是今后研究的重点,在此基础上,优化发酵乳工艺条件,生产降胆固醇发酵乳,对高脂血症人群进行营养干预,预防慢性病,提高全民的健康水平。