骞 宇,雷爱玲,刘晓敬,易若琨,赵 欣

(重庆第二师范学院生物与化学工程学院,重庆市功能性食品协同创新中心,重庆市功能性食品工程技术研究中心,功能性食品研发重庆市工程实验室,重庆 400067)

牦牛酸乳是我国青藏高原地区少数民族牧民经常食用的一种自然发酵乳制品,其含有各类营养成分,具有多种生物活性作用,是一种优质的天然食品[1]。牦牛酸乳的品质受到原料和发酵环境的影响,特别是不同环境下发酵微生物的差异对品质产生较大影响,因此不同地区牦牛酸乳的抗氧化能力、调节免疫力作用均有一定差异[1-2]。牦牛酸乳由于特殊的发酵环境和特殊的发酵工艺,其微生物组成与一般乳酸有较大差异[3],牦牛酸乳中含有大量乳酸菌,对其进行深入的分离鉴定可分离出具有益生菌潜质的优质乳酸菌[4-5]。

溃疡性结肠炎(UC)是一种发病率较高的炎症性肠病,通过动物模型研究食品对溃疡性结肠炎的作用效果和机制是常用的方法[6]。其中葡聚糖硫酸钠(DSS)造模可以形成类似临床的溃疡性结肠炎表现,是最为理想的溃疡性结肠炎模型[7]。肠道出现UC损伤后,乳酸菌在肠道中发挥其抗氧化作用,清除肠道内的自由基能够缓解UC[8]。肠道逐渐出现炎症状态时肠黏膜通透性将发生变化,炎症加剧时,肠黏膜通透性也将大幅度提高[9-10]。研究显示植物乳杆菌BLP可通过改善肠黏膜通透性缓解DSS诱导的结肠炎[11]。临床研究也报道乳酸菌在UC药物治疗期间能够有明显的协助作用,可以有效地加强治疗效果[12]。乳酸菌通过多种途径对UC起到缓解作用,但是对其机制的研究还缺乏深入研究。同时,本研究团队从牦牛酸乳中分离鉴定出了新的乳酸菌菌种,其作用机制也有待进一步研究。

本研究以从青海玉树藏族自治州的自然发酵牦牛酸乳中分离鉴定的乳酸菌LactobacillusplantarumYS-2(LP-YS2)为研究对象,观察LP-YS2对DSS诱导结肠炎的抑制作用。利用包括分子生物学方法,特别是观察结肠相关基因表达的变化,检测LP-YS2对结肠炎实验动物的影响,验证LP-YS2对DSS诱导结肠炎的抑制效果,为深入利用LP-YS2积累理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

七周龄雄性C57BL/6J小鼠 购自于重庆医科大学实验动物中心(许可证号:SYXK(渝)2012-0001);LactobacillusplantarumYS-2 由本研究组分离自青海玉树自然发酵牦牛酸乳中,保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号:CCTCC M 2016748);MRS肉汤培养基 北京索莱宝科技有限公司;柳氮磺胺吡啶、葡聚糖硫酸钠(DSS,分子量40 kDa) 美国Sigma公司;内皮素(ET)、生长抑素(SS)、P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)测定试剂盒 北京普尔伟业生物科技有限公司;IL-2、IL-10血清细胞因子测定试剂盒 美国BioLegend公司;髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;SYBR Green PCR Master Mix 美国赛默飞公司;逆转录试剂盒、qPCR引物 北京天根生化科技有限公司;其余试剂 均为国产分析纯；MRS液体培养基 48 g MRS肉汤培养基加热溶解于1 L蒸馏水中,121 ℃高压灭菌 15 min。

Biomate3S紫外可见光分光光度仪、A200PCR仪、LUX多功能性酶标仪、Stepone plus荧光定量PCR仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;ICEN-24R高速冷冻离心机 杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验菌种准备 接种LactobacillusplantarumYS-2菌种在MRS液体培养基(48 g MRS肉汤培养基加热溶解于1L蒸馏水中,121 ℃高压灭菌 15 min)中36 ℃培养24 h,然后离心分离(3000 r/min,10 min),弃去上层培养基,加入生理盐水与下层乳酸菌混匀,调节浓度至1×108CFU/mL和1×109CFU/mL,以备动物实验进行灌胃。

1.2.2 动物实验 小鼠饲养于室温(25±2) ℃、相对湿度(50%±5%)的环境中,同时保持饲养环境每12 h调节光/暗。适应饲养一周后选择50只体重(25±2) g的C57BL/6J小鼠,将小鼠分为5组,分别为正常组、模型组、LP-YS2-L组(低浓度LP-YS2灌胃组)、LP-YS2-H组(高浓度LP-YS2灌胃组)和柳氮磺胺吡啶组(阳性对照组)。实验周期5周,实验过程中,正常组小鼠给予自由摄入饮水和饮食,同时每日灌胃0.2 mL生理盐水;除正常组小鼠外,其余各组小鼠在第3周和第5周分别给予2%和4%(w/v)的DSS水溶液,其余时间给予自由摄入饮水和饮食;LP-YS2-L和LP-YS2-H组小鼠除给予自由摄入饮水和饮食外每日灌胃0.2 mL的1×108CFU/mL和1×109CFU/mL的LP-YS2;柳氮磺胺吡啶组小鼠除给予自由摄入饮水和饮食外每日按浓度20 mg/kg bw灌胃柳氮磺胺吡啶[13]。5周后实验结束后采用断颈法处死小鼠,然后测定小鼠结肠的质量和长度,同时取血和结肠组织待用。

1.2.3 小鼠血清ET-1、SS、SP和VIP水平测定 取小鼠血浆后在4500 r/min条件下离心分离15 min分离得到血清,然后按试剂盒方法测定血清和结肠组织中ET-1、SS、SP和VIP的水平[14]。

1.2.4 小鼠血清中IL-2和IL-10细胞因子水平的测定 按1.2.3方法对小鼠结肠血浆进行处理得到血清,然后按试剂盒方法测定小鼠血清中的IL-2和IL-10细胞因子水平[14]。

1.2.5 小鼠结肠组织中MPO、SOD含量和GSH、MDA活力的测定 结肠组织与生理盐水按照质量比1∶9混合后用超声粉碎将结肠组织进行匀浆处理,然后按试剂盒方法测定结肠组织中MPO、SOD的活力和GSH、MDA含量[14]。

1.2.6 qPCR实验测定小鼠结肠组织mRNA表达 将小鼠结肠组织打碎,然后用RNAzol提取结肠组织的总RNA,并将提取到的总RNA浓度稀释到1 μg/μL。取5 μL稀释后的总RNA提取液,按逆转录试剂盒方法进行逆转录得到cDNA模板。取2 μL的cDNA模板,和10 μL的SYBR Green PCR Master Mix、上下游引物(表1)各1 μL进行混合,在反应条件95 ℃,60 s后再进行40个循环:95 ℃,15 s;55 ℃,30 s;72 ℃,35 s;然后95 ℃,30 s;55 ℃,35 s进行检测,并以GAPDH为内参,根据公式2-ΔΔCt=ΔCt(检测基因)-ΔCt(GAPDH)计算基因的相对表达量[15]。

表1 逆转录聚合酶链反应引物序列

1.3 数据分析

将3次的实验结果取平均值,然后使用统计软件SAS9.1利用one-way ANOVA方法对各组实验结果在p<0.05 水平上是否具有显著差异进行分析。

2 结果与讨论

2.1 LP-YS2对结肠的作用

DSS诱导小鼠结肠炎后小鼠出现便血及体重下降,同时解剖后观察到小鼠结肠长度变短及出现肿大,判断为造模成功[16]。实验结果显示模型组小鼠的结肠长度最短,正常组小鼠最长;同时模型组小鼠的结肠质量/结肠长度也最低,正常组小鼠最高(表2)。研究证实DSS诱导的结肠炎小鼠其结肠质量和结肠长度与正常小鼠均出现差异,总结之前的研究,可用结肠质量/结肠长度的比值作为实验性溃疡性结肠炎程度的重要评价标准。由实验结果可以看出,LP-YS2-H可以显著(p<0.05)缓解DSS诱导结肠炎造成的结肠长度和结肠质量/结肠长度比值降低,且效果与20 mg/kg bw灌胃量的药物柳氮磺胺吡啶接近,同时效果显著优于LP-YS2-L(p<0.05)。

表2 各组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度比值

2.2 LP-YS2对小鼠血清ET-1、SS、SP和VIP水平的作用

由表3可以看出正常组小鼠血清中的SS和VIP水平均高于其余各组,而ET水平则低于其余各组;模型组小鼠则显示出相反的情况,其小鼠血清中ET和SP水平最高,而SS和VIP水平最低。相对于模型组,LP-YS2可以显著(p<0.05)提高结肠炎小鼠血清中的SS和VIP水平和显著降低ET和SP水平,且高浓度LP-YS2(LP-YS2-H)的效果更好,接近于药物阳性对照柳氮磺胺吡啶组。研究表明内皮素的血管收缩作用可以引起结肠黏膜的糜烂,甚至溃疡,能加剧结肠炎[17-18]。SS能够通过抑制胃酸等胃肠液的分泌减轻胃肠炎症,SS的减少将加剧胃肠液的分泌,加重结肠炎[19]。P物质是细神经纤维内的一种神经肽,能够调节神经系统与免疫系统,P物质的大量积累可加剧结肠炎的程度[18]。同时过量的P物质可诱发结肠炎,拮抗动物体内P物质后能缓解结肠炎[20]。VIP能够抑制机体内iNOS的转录,避免结肠组织中过量的iNOS转化成NO,从而导致肠黏膜的损伤;也能够控制结肠炎对免疫系统紊乱[19-21]。通过抑制ET、SP水平和增加SS、VIP水平能够缓解结肠炎,本研究中LP-YS2可以通过以上作用起到抑制溃疡性结肠炎的作用。

表3 各组小鼠血清的ET、SS、SP和VIP水平

2.3 LP-YS2对小鼠血清IL-2和IL-10细胞因子水平的作用

由表4可知,模型组小鼠血清的IL-2细胞因子水平显著(p<0.05)低于其余各组小鼠;在LP-YS2作用下,LP-YS2-H和LP-YS2-L组小鼠血清的IL-2细胞因子水平显著提高(p<0.05),并且LP-YS2-H作用下IL-2水平略低于药物柳氮磺胺吡啶的作用。相反的,模型组小鼠血清的IL-10水平最高,正常组小鼠最低,LP-YS2-H作用下小鼠的IL-10水平仅低于药物物柳氮磺胺吡啶组和正常组小鼠。IL-2是Th2细胞分泌的细胞因子,与UC直接相关;Th2细胞介导免疫反应影响UC,IL-2在过程通过影响Th2细胞起到抑制炎症的作用,减轻UC程度[22-24]。IL-10是具有免疫抑制作用的Treg细胞分泌的细胞因子,能够促进结肠炎的发展[24];LP-YS2能够提升IL-2水平和降低IL-10水平,通过调控机体免疫系统缓解结肠炎。

表4 各组小鼠血清细胞因子IL-2和IL-10水平的影响

2.4 LP-YS2对小鼠结肠组织MPO、SOD活力和GSH、MDA含量的作用

由表5可知,正常组小鼠结肠组织中的GSH含量和SOD活力最强,MPO活力和MDA含量最弱,体内保持正常的氧化水平,未见自由基对机体造成损伤;DSS诱导结肠炎后,GSH含量和SOD活力显著(p<0.05)下降,而MPO活力和MDA含量则显著(p<0.05)上升。LP-YS2和柳氮磺胺吡啶可以显著(p<0.05)抑制DSS造成的GSH含量、SOD活力下降和MPO活力、MDA含量上升。同时,相对于模型组小鼠高浓度的LP-YS2(LP-YS2-H)能够更显著(p<0.05)的上升小鼠结肠组织的GSH含量、SOD活力和下调MPO活力、MDA含量。结肠病变发生炎症后组织中中性粒细胞聚集开始下降,大量中性粒细胞内流进入组织使MPO活力大幅度提高[25],同时ROS和RNS等自由基大量聚集,进一步使结肠组织发生损伤和毒性反应,加剧结肠炎[26]。实验和临床研究都证实发生结肠炎后,结肠组织中的GSH含量和SOD活力大幅度降低,同时过氧化产物MDA则大幅度上升[27-28],由此证实控制自由基在组织中的聚集,增强抑制氧化的酶活力,可以起到抑制结肠炎的作用。本研究的实验结果也证实UC导致SOD活力和GSH含量下降,而MPO活力和MDA含量增强,LP-YS2可显著(p<0.05)抑制UC对结肠造成的氧化应激反应,抑制结肠炎。

表5 各组小鼠结肠组织的MPO、GSH、MDA和SOD活力

2.5 LP-YS2对小鼠结肠组织nNOS、eNOS和iNOS mRNA表达的作用

由表6可知,DSS诱导结肠癌后可导致小鼠结肠中nNOS和eNOS的mRNA相对表达量下降,而iNOS相对表达量上升。LP-YS2可上调DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中的nNOS和eNOS相对表达量和下调iNOS的相对表达量,且LP-YS2-H上调nNOS和eNOS相对表达量和下调iNOS的相对表达量显著(p<0.05)强于LP-YS2-L,LP-YS2-H作用小鼠结肠的nNOS、eNOS和iNOS相对表达量略低于柳氮磺胺吡啶20 mg/kg bw灌胃作用小鼠的相对表达量。有研究显示eNOS可以控制产生适量的NO,从而保持结肠组织处于正常状态,对结肠炎引起的结肠损伤有重要的控制作用;iNOS则能转化出大量的NO,过量的NO对结肠组织的损伤具有副作用,加剧结肠的损伤[29]。nNOS也可以控制NO在组织中的浓度,维持组织不受到过量NO的侵害,同时nNOS还可以控制iNOS的过量表达,抑制炎症[29-30]。本研究中LP-YS2-H组小鼠由于受到LP-YS2-H的作用,上调了结肠中nNOS、eNOS表达和下调了iNOS表达,对结肠炎起到了抑制作用。

表6 LP-YS2对小鼠结肠组织nNOS、eNOS和iNOS mRNA表达的作用

2.6 LP-YS2对小鼠结肠组织c-Kit和SCF mRNA表达的作用

由表7可知,正常组小鼠结肠组织中c-Kit和SCF的mRNA相对表达强度最高,模型组小鼠结肠中的c-Kit和SCF相对表达强度最低。LP-YS2-H组小鼠结肠中的c-Kit和SCF相对表达强度显著(p<0.05)高于LP-YS2-L组和模型组小鼠,低于柳氮磺胺吡啶组和正常组小鼠。UC导致结肠功能紊乱,结肠动力降低,UC导致正常的Cajal间质细胞数量降低,使结肠动力下降,与UC进程直接相关[31]。c-Kit和SCF对保持Cajal间质细胞数量有重要的作用,SCF/Kit 信号途径受损后,Cajal间质细胞不仅数量下降,Cajal间质细胞的增殖也将受到影响,使UC的症状加剧[32]。实验结果表明LP-YS2可通过上调结肠组织中c-Kit和SCF的表达抑制DSS诱导的结肠炎。

表7 LP-YS2对小鼠结肠组织c-Kit和SCF mRNA表达的作用

2.7 LP-YS2对小鼠结肠组织IL-8和CXCR2 mRNA表达的作用

由表8可知,DSS诱导结肠炎模型组小鼠结肠的IL-8和CXCR2 mRNA相对表达量最高,正常组小鼠结肠的相对表达量最低。药物柳氮磺胺吡啶组小鼠结肠的IL-8和CXCR2相对表达量仅高于正常组,低于其余各组。LP-YS2-H组小鼠结肠的IL-8和CXCR2相对表达量则显著(p<0.05)低于LP-YS2-L组和模型组小鼠。IL-8是一种中性粒细胞趋化和活化因子,可以介导多种途径诱发的炎症反应,包括能介导UC的炎症[33]。CINC-1是IL-8家族中的一种中性粒细胞趋化因子,CXCR2是CINC-1的受体,CXCR2能够起到介质作用来调控器官间相互作用,降低CXCR2在组织中的含量有助于减轻UC造成的结肠损伤[34-35]。LP-YS2可以显著下调结肠炎小鼠结肠中的IL-8和CXCR2 mRNA表达,从而抑制结肠炎。

表8 LP-YS2对小鼠结肠组织IL-8和CXCR2 mRNA表达的作用

3 结论

本研究采用DSS诱导小鼠结肠炎动物模型对从自然发酵牦牛酸乳中分离到的乳酸菌LP-YS2的结肠炎抑制效果进行了体外研究。通过对小鼠血清和结肠组织的观察,实验结果显示相对与结肠炎模型组小鼠,LP-YS2可以抑制结肠炎对小鼠造成的影响,缓解结肠炎,使小鼠机体各项指标向正常状态转换。由此可以看出,LP-YS2可以抑制DSS诱导的结肠炎,浓度与效果呈正相关,高浓度LP-YS2的作用更为强烈。LP-YS2是一种具有结肠炎抑制效果的优质乳酸菌,有待进一步开发利用。