李武国,苏 乔,*,魏洁书,梁绮文,刘翠婷,朱烨妍,赵广银,李雯雯,黄浩机,李文英,曹伟杰,詹若挺

(1.中山大学附属第一医院动物实验中心,广东广州 510080;2.中山大学新华学院,广东广州 510520;3.南方医科大学中心实验室,广东广州 510515;4.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心/岭南中药资源教育部重点实验室,广东广州 510006)

莲雾(SyzygiumsamarangenseMerr. et Perry),又称洋蒲桃、水蒲桃等,为桃金娘科蒲桃属热带常绿小乔木,原产于马来半岛、安达曼群岛。在马来西亚、印尼、菲律宾以及我国台湾、广东、福建南部、广西等地普遍栽培。莲雾性平味甘,具有一定的保健治疗功能,能润肺、止咳、除痰、凉血、收敛,可治肺燥咳嗽等[1]。莲雾叶、花与果实含有丰富的油腺,可提取芳香油。目前,国内外关于莲雾叶、花与果实的挥发性成分分析均有文献报道[2-6],其中,李海泉等[2]利用超临界CO2萃取获得了莲雾叶精油,并进行了成分分析。但是莲雾叶挥发油的体外生物活性却鲜有报道。利用水蒸气蒸馏法提取获得的莲雾叶挥发油与超临界CO2萃取获得的莲雾叶精油化学成分是否一致,这有待于进一步的研究。

白千层(MelaleucaleucadendronL.),桃金娘科白千层属乔木,又名千层皮、脱皮树、玉蝴蝶、玉树等,原产澳大利亚,我国海南、广东、福建、广西、台湾均有分布,其精油具有镇痛、驱虫及防腐等功效,可治耳痛、牙痛、风湿痛及神经痛等[7]。目前,国内外关于白千层挥发油的化学成分分析的文献早有报道,但多集中于对其枝叶、果实挥发油及其抗菌活性的研究[8-14]。廖子坚等[15]比较分析了超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏互叶白千层挥发油的化学成分,发现两种提取方法得到的挥发油化学成分有较大差异。白千层枝叶挥发油是一种优良的天然抗菌剂,具有很好的开发前景,但其在其它生物活性方面的应用则有待探究。

莲雾、白千层同属于桃金娘科,但其叶挥发油的化学成分以及抑制人肺癌A549、H460细胞增殖活性是否一致有待于探究。本研究通过水蒸气蒸馏法分别提取莲雾叶、白千层叶中的挥发油,通过 GC-MS分析和鉴定这两种挥发油的化学组成,并对比分析其化合物种类和质量百分含量的异同,同时采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定了莲雾叶、白千层叶挥发油对人肺癌A549、H460细胞的细胞增殖抑制活性,为莲雾叶、白千层叶挥发油的综合开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人肺癌A549、H460细胞 由广东省实验动物监测所李文德研究员赠送;莲雾叶、白千层叶 均采自中山大学北校园,阴干备用,经广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺研究员分别鉴定为桃金娘科蒲桃属莲雾SyzygiumsamarangenseMerr. et Perry干燥叶、桃金娘科白千层属白千层MelaleucaleucadendronL.干燥叶;莲雾干燥叶(QW10201)、白千层干燥叶(QW10301)标本 保存于中山大学附属第一医院动物实验中心;胎牛血清(批号:42G5550K)、DMEM培养基(批号:8117108)、Pen Strep(青链霉素)(批号:1881450)、0.25% Trypsin-EDTA(0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸)(批号:1676922)、PBS(磷酸盐缓冲液;pH为7.4)溶液(批号:8117157) 美国Gibco公司;MTT(四甲基偶氮唑盐)粉末(批号:3580GR001) 德国Biofroxx公司;DMSO(二甲基亚砜)(批号：20170724) 天津市大茂化学试剂厂。

Class Ⅱ BSC型生物安全柜 新加坡ESCO公司;BIOFUGE PRIMO R型离心机、HERACELL 150i型CO2培养箱、Multiskan FC型酶标仪 美国Thermo公司;ZW-A型微量振荡器 江苏科析仪器有限公司;Voyager型气相色谱-质谱联用仪,配有NIST Search 2.0质谱检索库、TG WAXMSTG石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美国Finnigan公司;98-Ⅰ-B型电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司;1000 mL型挥发油提取器 北京博美华科玻璃有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 莲雾叶、白千层叶挥发油的提取 将莲雾干燥叶、白千层干燥叶剪碎,分别称取200 g莲雾干燥叶、白千层干燥叶于挥发油提取器中,加6倍水浸泡1 h后蒸馏6 h,收集挥发油,干燥,称重,计算得率。得率(%)=挥发油质量/叶质量×100。

1.2.2 气相色谱条件 TG WAXMSTG石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升温:初始温度40 ℃,保持3 min,以6 ℃/min升至130 ℃,以2 ℃/min升至210 ℃,以20 ℃/min升至300 ℃;进样口温度270 ℃;载气为高纯氦气,载气流速1 mL/min,恒流模式;分流进样,分流比20∶1,进样量0.1 μL。

1.2.3 质谱条件 离子源温度为230 ℃;电离方式为电子轰击(EI)源,电子轰击能量为70 eV;ACQ方式为Full Scan,扫描速度为2200.19 amu/s,扫描质量范围为m/z 33～450,溶剂延迟时间为3 min。

1.2.4 挥发性成分相对含量计算 各化学成分通过标准质谱图库NIST Search 2.0进行检索匹配,人工解析质谱并确证化合物的结构,采用峰面积归一法计算分离鉴定化学成分的相对百分含量。

1.2.5 莲雾叶、白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460细胞增殖能力的影响 通过MTT法[16-17]评价莲雾叶、白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460细胞增殖能力的影响。体外培养人肺癌A549、H460细胞,待细胞生长至对数生长期时收集细胞,消化后计数,在96孔板中每孔分别加入约3000、2500个细胞,放入细胞培养箱培养。细胞接种于96孔板24 h后,吸弃各孔中的培养液,空白对照组每孔加入100 μL含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培养液,给药组每孔分别加入100 μL含10% FBS和不同浓度(0、1、5、10、20、40、60、80、100和120 mg/L)的莲雾叶、白千层叶挥发油的DMEM培养液,每组平行设置3个孔,37 ℃、5% CO2培养24 h,每孔加入20 μL 5 g/L MTT,培养4 h,吸弃培养基,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min。酶标仪490 nm测定OD值。OD值用于计算细胞相对活力,细胞相对活力=给药组OD值/空白对照组OD值。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析,分析方法为单因素方差分析。p<0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 莲雾叶挥发油的提取及GC-MS分析

水蒸气蒸馏法提取莲雾干燥叶200 g,获得0.4 g挥发油,得率分别为0.2%。对挥发油进行GC-MS分离分析,得总离子流图,见图1。

图1 莲雾叶挥发油的总离子流图

莲雾叶挥发油总离子流图中的各峰经过NIST Search 2.0质谱数据库检索,并经人工逐一核对解析质谱图,确认化合物结构,采用面积归一化法计算各谱峰化合物的相对百分含量,结果见表1。

表1 莲雾叶挥发油GC-MS分析

莲雾叶挥发油总离子流图中,共分离获得54个化学组分峰,其中鉴定确证38种化合物,占总检测到化学成分相对百分含量的94.52%,含量较高的化合物是石竹烯(16.91%)、à-芹子烯(16.33%)、β-桉叶烯(15.43%)、(+)-δ-杜松烯(7.07%)和蓝桉醇(6.54%)等,其相对含量之和为62.28%。其中石竹烯相对含量最高,是莲雾叶挥发油的主要化学成分之一。与李海泉等[2]利用超临界CO2萃取获得的莲雾叶精油的化学成分进行对比,超临界CO2萃取的莲雾叶精油含有更多的化学组分峰(79个),但是只鉴定了36种化合物,相对含量较高的五个化合物分别为β-石竹烯(14.32%)、δ-杜松烯(11.78%)、τ-杜松醇(8.85%)、γ-杜松烯(5.87%)和α-杜松醇(5.27%),其相对含量之和为46.09%,该研究的主要化学成分种类、相对百分含量均与本研究存在较大的差异,这可能是由于不同的挥发性成分提取方法造成的。

2.2 白千层叶挥发油的提取及GC-MS分析

水蒸气蒸馏法提取白千层干燥叶200 g,获得3.4 g挥发油,得率为1.7%。对挥发油进行GC-MS分离分析,得总离子流图,见图2。

图2 白千层叶挥发油的总离子流图

白千层叶挥发油总离子流图中的各峰经过NIST Search 2.0质谱数据库检索,并经人工逐一核对解析质谱图,确认化合物结构,采用面积归一化法计算各谱峰化合物的相对百分含量,结果见表2。

表2 白千层叶挥发油GC-MS分析

国内关于白千层叶挥发油的活性研究主要集中在抗菌方面,而本研究对白千层叶水蒸气蒸馏获得的挥发油进行了GC-MS分析，并利用MTT法对白千层叶挥发油进行了体外抗肿瘤活性评价。GC-MS分析结果显示,白千层叶挥发油总离子流图中,共分离获得36个化学组分峰,其中鉴定确证28种化合物,占总检测到化学成分相对含量的99.27%,相对含量较高的化合物是桉树脑(47.47%)、()-2,6,6-三甲基双环[3.1.1]庚-2-烯(12.64%)、α-松油醇(12.09%)、D-柠檬烯(10.20%)和表蓝桉醇(8.25%)等,其相对百分含量之和为90.65%。其中桉树脑相对含量最高,是白千层叶挥发油的主要化学成分之一。汪燕等[18]研究者采集了华南农业大学校园里的白千层叶片,利用水蒸气蒸馏法提取获得了白千层叶片挥发油,并进行了GC-MS分析,结果显示,其主要成分包括桉树脑(48.372%)、凤蝶醇(13.641%)、α-松油醇(10.004%)、蒎烯(6.411%)和柠檬烯(4.881%)等,其相对百分含量之和为83.309%。虽然白千层叶都采集于广东省广州市内,但是与本研究所获得的白千层叶挥发油相比,主要化学成分及其相对含量均存在一定的差异,这可能与生长环境、采集时间等有关。桉树脑(又称为桉油精)，作为白千层叶挥发油含量最高的化合物,具有抗菌、抗炎、杀虫、镇痛、促进透皮吸收等作用[19-20],但马兴苗等[21]利用MTT法评价了桉油精对胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45的细胞生长抑制作用,结果表明,桉油精对上述四种胃癌细胞生长均无显著抑制作用。本研究利用MTT法评价了白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460的细胞增殖抑制作用,结果显示,白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460均无明显生长抑制作用。该结果提示,白千层叶挥发油的主要成分桉树脑对人肺癌细胞A549、H460很可能无显著的生长抑制作用。

2.3 莲雾叶挥发油与白千层叶挥发油共有化合物对比分析

对莲雾叶和白千层叶挥发油GC-MS分析结果进行对比,可以发现,莲雾叶挥发油含有更丰富的挥发性化合物,鉴定确证的化合物也更多,含量较高的五个化合物均不相同。两种挥发油有13种共有化合物,分别为á-月桂烯、癸烷、1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯、D-柠檬烯、异松油烯、5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)环己醇、萜品-4-醇、α-松油醇、à-石竹烯、香橙烯、石竹烯氧化物、库贝醇、τ-杜松醇。13种共有化合物相对保留时间基本一致,相对含量均有差别(见表3),其中,D-柠檬烯(莲雾叶0.70%、白千层叶10.20%)、α-松油醇(莲雾叶1.24%、白千层叶12.09%)、à-石竹烯(莲雾叶1.34%、白千层叶0.08%)、香橙烯(莲雾叶0.43%、白千层叶0.05%)、库贝醇(莲雾叶1.03%、白千层叶0.09%)、τ-杜松醇(莲雾叶1.12%、白千层叶0.04%)6种化合物的相对含量差异较大。

表3 莲雾叶挥发油与白千层叶挥发油共有化合物对比分析

2.4 莲雾叶、白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460细胞增殖能力的影响

通过MTT法评价莲雾叶、白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460细胞增殖能力的影响。测试结果(见图3)表明,莲雾叶挥发油分别对人肺癌细胞A549、H460作用24 h后,在浓度为40 mg/L时，对人肺癌细胞A549的细胞增殖能力产生显著的抑制作用(p<0.05),并呈剂量依赖性,抑制作用随着浓度的增大而增强,其IC50值为49.99 mg/L;在浓度为60 mg/L时，对人肺癌细胞H460的细胞增殖能力产生极显著的抑制作用(p<0.001),并呈剂量依赖性,抑制作用随着浓度的增大而增强,其IC50值为65.70 mg/L。各浓度的白千层叶挥发油(1、5、10、20、40、60、80、100和120 mg/L)分别对人肺癌细胞A549、H460作用24 h后,细胞相对活力与空白对照组相当,说明白千层叶挥发油对A549、H460细胞无明显生长抑制作用(p>0.05)。

图3 莲雾叶、白千层叶挥发油对人肺癌细胞A549、H460细胞增殖能力的影响

3 结论

本研究通过 GC-MS 分析和鉴定了莲雾叶挥发油与白千层叶挥发油的化学组成,结果显示,虽然莲雾、白千层同属于桃金娘科,但其叶挥发油所含化合物种类、同一化合物相对含量各不相同。MTT测试结果表明,虽然莲雾叶挥发油与白千层叶挥发油含有13个共有成分,但其对人肺癌细胞A549、H460的细胞增殖能力所产生的影响存在较大差异。作用24 h后,莲雾叶挥发油在浓度为40 mg/L时，对人肺癌细胞A549的细胞增殖能力产生显著的抑制作用(p<0.05),在浓度为60 mg/L时，对人体癌细胸H460的细胞子增殖能力产生极显著的抑制作用(p<0.001),而浓度等于或小于120 mg/L的白千层叶挥发油对人肺癌A549、H460细胞均无明显生长抑制作用(p>0.05)。