朱仙娜,戴璐瑶,张一斐,金 燕,陈梅兰

(浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015)

在黄酒的酿造过程中,浸米是一个重要环节,它不仅能使大米充分吸水膨胀便于蒸煮,更可以使浆水中的产酸菌利用大米的营养物质迅速繁殖,代谢产生大量酸类物质,使浆水酸度增加以调节发酵醪液的酸度,保障发酵的安全进行[1]。米浆水中含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸及大量有机酸,包括乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、草酸等[2]。米浆水中的有机酸对于黄酒的口感风味影响较大,乳酸、苹果酸和柠檬酸口感较为爽净,而乙酸是一种刺激性酸,口味较软。小分子有机酸还是黄酒中重要的助香物质,对于丰富酒质香味和提高酒品质有着至关重要的作用[3],而且适量的有机酸摄入能够促进人体的代谢、增强免疫力。米浆水是黄酒生产中的主要副产物,由于其含丰富的营养物质,因此国内较多厂家不断尝试米浆水的循环利用。例如,胡健[4]等人研究了米浆水的回用技术对黄酒酿造的影响。但由于米浆水中含大量的有机酸导致酸度较高,影响了米浆水的后续的循环利用,目前对米浆水中有机酸含量变化研究主要在集中在对乳酸的研究。如姬中伟[5]研究总酸和乳酸的含量变化及对黄酒品质的影响,未涉及具体的有机酸含量的变化研究。因此,研究米浆水中各类有机酸含量随大米产地、包装方式及浸米时间的变化,可以有效地控制有机酸在黄酒生产过程中的生产量,从而提高米浆水回收利用的效率,不仅节能环保,而且能促进我国黄酒产业的长远发展。

目前检测有机酸的方法较多,主要有离子色谱电导法[6-7]、离子排斥色谱法[8-9]、高效液相色谱法[10-12]、毛细管电泳法[13]、柱后缓冲电导法[14]、梯度淋洗-离子色谱法测定[15]等。如黄海兰[16]等使用离子色谱法测定蓝藻培养液中有机酸和无机阴离子,杨春霞[17]等采用离子色谱法分析了葡萄酒酿造过程中有机酸的变化规律等。其中离子色谱电导检测法是小分子有机酸的最佳检测方法[18],可以同时分离和测定有机酸和无机阴离子,该方法操作简单,方便可行,但是所需要的检测时间较长,其检出限较高,容易受基质干扰。本研究采用传统的离子色谱法检测浸米浆水中的有机酸含量,并对方法进行优化,缩短了检测时间对实验的影响,并根据建立的方法对浸米发酵过程中不同产地、包装方式及浸米时间对于黄酒生产过程中有机酸(乳酸、乙酸、甲酸、草酸、苹果酸)含量的变化进行了研究,从而为黄酒生产过程中有机酸含量的控制和米浆水在黄酒生产过程中的循环利用提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

散装江苏盐城糯米、散装吉林糯米 市售;氮气保护包装吉林糯米 吉林宝龙仓农产品开发有限公司;氮气保护包装江苏糯米 金坛市江南制粉有限公司;甲酸、乳酸、苹果酸、草酸、乙酸标品 华东医药股份有限公司;超纯水 Millipore,Molisheim,France,电阻率18.2 MΩ·cm。

赛默飞ICS 5000离子色谱仪、配电导检测器、抑制器Suppressor. DionexTMAERTM500(4 mm)、Dionex KOH自动淋洗液发生器、IonPac AS11-HC分析柱(4 mm×250 mm)、IonPac AG11-HC保护柱(4 mm×50 mm) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;TGL-16B离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 用超纯水配制乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、草酸5种有机酸(1000 mg/L)的标准贮备液,使用时配制成1、2、5、10、20 mg/L浓度的混合标准溶液。

1.2.2 米浆水的制备 取4种不同产地大米(散装江苏盐城糯米、散装吉林糯米、氮气保护包装江苏糯米、氮气保护包装吉林糯米)各10份,每份均为100 g,分别置于500 mL三角瓶中,注入150 mL清水浸制,将三角瓶置于生化培养箱中,并保持培养箱温度为20～22 ℃,每隔1 d,取出1个三角瓶中的米浆水进行检测[19]。

1.2.3 样品的前处理 分别取10 mL浸米时间为1、2、3、5、6、7、8 d的米浆水于10 mL圆底离心管中,在TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机中,于4000 r/min的转速下离心20 min后,取上清液于1.5 mL尖底离心管中,放入TGL-16B离心机以13000 r/min的转速运行5 min,再次取上层清液于0.45 μm滤膜过滤,滤液进色谱分析。

1.2.4 色谱条件优化 查阅文献[20]可知,浸米浆水中可能存在甲酸、乳酸、苹果酸、草酸、乙酸等有机酸。为获得理想的分离度和峰形,实验尝试了30 mmol/L KOH高浓度等度洗脱,10 mmol/L KOH低浓度等度洗脱和1～50 mmol/L KOH时间梯度洗脱。

1.2.5 样品及加标样品的制备 取浸米时间1、2、3、5、6、7、8、9 d的米浆水先按照1.2.3的样品前处理的方法处理稀释合适倍数进行测定。另取对浸取2 d的米浆水进行加标实验(主要是考虑到米浆水发酵2 d后乳酸、乙酸含量不高,加标后的量在实验的线性范围之内),加标量为1.0 mg/L进行测定。

1.2.6 定量分析 在1.2.4的色谱条件下,对5种浓度有机酸标样分别测定8次,变色龙6.80软件进行峰面积计算,对浓度和峰面积进行线性回归,得线性方程。样品每天在同一时间取样,重复6次计算平均峰面积,代入回归方程,计算各有机酸的含量。对样品进行加标回收实验来验证方法的准确性。

2 结果与分析

2.1 色谱优化结果

根据多次实验优化结果,确定的最终色谱条件为:流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,淋洗程序见表1。色谱图见图1。

图1 5种有机酸分离色谱图

表1 淋洗液梯度程序

2.2 方法的线性范围及检出限

按1.2.4的色谱条件对甲酸、乳酸、苹果酸、草酸、乙酸5种有机酸标准溶液进样分析,并进行浓度和峰面积线性回归(线性范围为1、2、5、10、20 mg/L),回归系数和相对标准偏差(5 mg/L的标准溶液重复进样8次)如表2所示。由表2可知,5种有机酸所建立的回归方程相关系数R2分别为1.0000、0.9995、1.0000、0.9999、0.9999,检出限0.0787、0.1006、0.0346、0.1283、0.1037 mg/L,相对标准偏差分别为2.06%、2.26%、2.37%、2.13%、2.89%,该方法具有良好的重现性和检出限。

表2 5种有机酸的线性方程、回归系数和相对标准偏差

2.3 样品测定及方法的回收率

样品的测定具体见表3,色谱图见图2,样品加标回收率均在90.23%～97.43%之间。

表3 米浆水中5种有机酸的测定值及加标回收率

图2 米浆水样品(2 d)稀释200倍的有机酸色谱图

2.4 不同产地、包装方式及浸米时间对米浆水中有机酸含量的影响

2.4.1 不同产地对有机酸含量的影响 不同产地的糯米对浸米浆水中有机酸含量的影响如表4所示。由表4可知,对于包装糯米而言,江苏糯米与吉林糯米浸米浆水中乳酸的含量差异最大,达到970.37 mg/L;其次两个产地之间草酸、乙酸差异明显,分别相差232.89、66.29 mg/L;甲酸、苹果酸两地含量差异较小,总体上,江苏糯米浸米浆水种有机酸含量大于吉林糯米。对于散装糯米而言,江苏糯米与吉林糯米浸米浆水中乳酸的含量差异最大,达到876.58 mg/L;其次两个产地之间草酸、乙酸差异明显,分别相差168.60、54.87 mg/L;甲酸、苹果酸两地含量差异较小,与包装糯米的结果一致;说明产地对黄酒生产过程中米浆水中有机酸含量有一定影响,江苏糯米浸米浆水中有机酸含量大于吉林糯米。其原因是,浸米过程就是乳酸菌发酵分解微量元素产生有机酸[21],而米浆水的起发速度与米中微量成分如维生素、核苷酸等的含量有关,这些微量成分能够促进乳酸菌快速生长、繁殖并影响发酵产物的多少,微生物成份多,起发快,微量成份少,起发慢,不同产地糯米中这些微量成分的含量有所差异,最终可能影响各种有机酸含量的高低。另外,由于不同产地的糯米的精白度不同,在相同条件下浸渍,其米浆水总酸和浆水中微生物是不同的;即浸米特性是不同的[22],最终导致有机酸含量的不同。

表4 不同产地、包装方式米浆水中5种有机酸含量峰值(mg/L)

2.4.2 不同包装方式对有机酸含量的影响 由表4可知,不同包装方式糯米浸米浆水中有机酸含量不同。其中,对于产地江苏的糯米而言,包装糯米的乳酸含量大大超过了散装糯米含量,两者相差3600.42 mg/L,乙酸、草酸含量比散装糯米高164.05、168.58 mg/L,甲酸、苹果酸含量差异不大。对于产地吉林糯米而言,包装糯米的米浆水中乳酸、乙酸、草酸分别比散装糯米高3506.63、152.63、104.29 mg/L,与产地江苏的糯米一致。由此可见,包装糯米米浆水中有机酸含量总体高于散装糯米。原因可能是包装方式明显影响浸米过程中微生物的生理生化反应,散装糯米的米质相对于包装糯米的米质较差,散装糯米吸潮后表面微生物发生变化,在实验过程中散装米放置时间久,米浆水明显出现发黄,散装米长期裸露在空气中受潮还会在其表面滋生大量霉菌,严重影响有益菌生长。

2.4.3 不同浸米时间对有机酸含量的影响 通过离子色谱分离电导检测法,所得米浆水浸出有机酸的含量随时间的变化结果如图8～图9所示,图8是甲酸、乙酸及苹果酸随时间的变化规律,图9是乳酸及草酸随时间变化图,实验所用的糯米为散装江苏盐城糯米。从图7和图8可知,在整个浸米过程中,5种有机酸的含量均呈现先升高后降低的趋势。在第2 d时,甲酸、乙酸、苹果酸达到峰值,分别为17.26、237.31、31.32 mg/L。在第5 d时,草酸含量达到峰值1706.82 mg/L。乳酸含量在浸米的第7 d达到峰值10746.03 mg/L。由于乳酸和草酸含量在5种有机酸中最高,占主体地位,因此在整个浸米周期中(现代黄酒生产浸米周期约8～12 d)[19],米浆水中的总酸含量是逐渐增加的。

图7 甲酸、乙酸、苹果酸含量随浸米时间变化曲线

图8 乳酸和草酸含量随浸米时间变化曲线

高温乳酸菌的生长和繁殖过程中,乳酸菌能促进醋酸菌生长,抑制酪酸菌生长,因此前期乙酸含量增加较快,在第2 d时,乙酸达到峰值,但大部分乳酸菌又会产生细菌素,如乳链菌素、噬酸菌素[23],这些细菌素反过来使醋酸杆菌渐渐失去活性,而导致醋酸含量下降。其中部分乙酸会转化成乙酸乙酯等酯类物质,从而产生酯类香味,因此米浆水中乙酸含量前期呈上升趋势,后期乙酸逐渐减少。

苹果酸是三羧酸循环(TCA)及其支路乙醛酸循环中的重要有机酸,也是CO2固定反应的产物[26]。微生物利用米浆水中的淀粉等糖类进行复杂的新陈代谢,或者通过直接发酵所产生。前期微生物生命活动十分旺盛,苹果酸含量急速增长,在第2 d达到含量最高,后期微生物苹果酸-乳酸发酵(二次发酵)[24],造成含量下降,也是米浆水后期败坏的原因之一。同时,在米浆水发酵过程中也会产生少量甲酸,在第2 d到达最大值。

草酸发酵是氧化发酵的一种,它能从糖或柠檬酸、醋酸等有机酸形成大量草酸[25],因此在菌类和高等植物中普遍地看到草酸的生成,同样草酸在第5 d时达到峰值,随着后期供能物质的减少,一些草酸与醇类发生酯化反应。

米浆水中优势菌种主要是乳酸杆菌,乳酸杆菌是一群生活在机体内有益于宿主健康的微生物,其维护人体健康和调节免疫功能的作用[26]。当米浆水酸度提高到pH约为4.5时,浸米初期水浆表面主要是乳酸杆菌,乳酸含量随时间变化大幅上升,乳酸在浸米的第7 d达到峰值达到峰值,后由于米浆水中的供能物质减少,部分乳酸菌自溶而产生酸性多糖磷酸质。因此,米浆水后期只能够单靠酵母和低温乳酸菌发酵提供营养,由于供能物质的减少逐渐衰败,乳酸菌死亡的同时会伴随着大量霉菌的出现,如黄曲霉等,因此后期乳酸含量开始下降。

3 结论

本文采用离子色谱分离电导检测法测定米浆水中的有机酸,通过优化分离条件和前处理方式,获得了理想色谱峰。方法学考察表明,本方法具有较好的线性,回收率和重现性较高,其中方法的回归系数R2≥0.9995,回收率在90.23%～97.43%,重现性RSD≤3.76%。并在该方法下研究了不同产地、不同包装方式以及不同浸米时间等因素对糯米浸米浆水中有机酸含量的影响。结果表明:不同产地的糯米浸米浆水产生的有机酸含量存在差异,相比于吉林糯米,江苏糯米产有机酸量更高。同时,其包装方式对乳酸产量有很大的影响,包装大米产乳酸量明显高于散装大米产乳酸量,原因可能是散装大米因受潮等导致微生物发生变化,所以采购及贮存时应注意大米防潮措施。随着浸米时间的延长,米浆水中的有机酸的含量均呈先增长后下降的趋势,前期微生物利用米浆水中的供能物质进行新陈代谢,使有机酸的含量快速增长,其中乳酸在有机酸中的含量最高,在浸米的第7 d达到峰值10746.03 mg/L,随后由于供能物质的减少,大量霉菌的出现,微生物逐渐衰败,有机酸的含量逐渐降低。