李 林,黄萍萍,李华敏,王亚萍,倪娓娓

(1.烟台市粮油质量检测中心，山东烟台 264001;2.鲁东大学食品工程学院，山东烟台 264025)

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是鱼油的特征脂肪酸,具有促进大脑发育、预防心脑血管疾病和消炎等多种重要的生理活性[1-4],建立高效准确的EPA和DHA含量的快速检测方法，对于评价鱼油产品质量、指导鱼油生产企业改进制备工艺具有重要意义。目前,EPA、DHA含量检测最普遍和准确的方法是气相色谱法[5-9],我国还专门制订了利用气相色谱法检测油脂中脂肪酸含量的国家标准GB5009.168-2016,具有准确率高、重现性好、各类脂肪酸物质分离度高的特点,但该法分析时间长,且其主要作用是用于分析C4～C22多种脂肪酸的含量,并未针对EPA、DHA的含量做单独说明。基于上述问题,本文在脂肪酸国标定量分析方法基础上,结合近年来国内外脂肪酸定量分析方法的研究成果,对黄鲛鱼内脏油脂中的定量分析方法进行了探究,以期获得快速、准确、重现性好的EPA、DHA气相色谱快速定量分析方法,并利用该法研究了不同萃取方法[10-16]对鱼油产品中EPA、DHA含量的影响规律,不仅为鱼油品质测评提供了新的气相色谱检测条件,还客观评价了不同萃取方法对鱼油品质的影响规律,为鱼油生产企业和相关研究工作者提供了新依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄鲛鱼鱼胃 烟台海和食品有限公司;异辛烷(分析纯)、甲醇(分析纯)、氢氧化钾(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、硫酸氢钠(分析纯) 天津科密欧化学试剂有限公司;EPA甲酯、DHA甲酯标准品,纯度>99% Sigma公司。

气相色谱仪、色谱柱(Rtx-5,30 m×25 mm) 岛津国际贸易有限公司;超声强化亚临界水设备(实验室自制)、超临界CO2萃取设备(HA220-50-06型) 杭州华黎泵业有限公司;DRHH-S4三列四孔恒温水浴锅 上海双捷实验设备有限公司;LT3002E电子天平 常熟市天量仪器有限责任公司;PS-10A超声波 洁康牌;RE-52系列旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂;DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱 上海惊宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼油样品的制备 以新鲜的黄鲛鱼鱼胃为原料,清洗、去杂质后,切成直径1 cm左右的颗粒,冷冻干燥(冷阱温度：-60 ℃，真空度：0.1 Pa,干燥时间24 h)后,放入密封盒内冻藏备用,分别利用超声强化亚临界水[11]、超声波辅助溶剂[12]、中性蛋白酶水解[15]和超临界CO2法[5,16]萃取黄鲛鱼鱼胃中的鱼油,萃取条件参考相关文献并结合实验情况,对各萃取方法的萃取温度和萃取时间进行了调整,具体萃取条件参数是:超声强化亚临界水(20 kHz,250 W,280 ℃,5022 kPa,60 min);超声波辅助溶剂(20 kHz,500 W,25 ℃,正己烷提取30 min);酶解(中性蛋白酶,加酶量1%(w/w),30 ℃,振荡提取5 h);超临界CO2(30 MPa,65 ℃,5 h,流体流速3 mL/min)。

1.2.2 鱼油脂肪酸甲酯化 参照国标GB/T 17376-2008脂肪酸甲酯的制备。

1.2.3 气相色谱分析条件 色谱柱:色谱柱(Rtx-5,30×0.25 mm,0.25 μm);进样器温度300 ℃;FID检测器温度320 ℃;燃烧气氢气流量30 mL/min;空气流量300 mL/min;进样量1 μL;以氮气为载气。通过改变升温程序温度、分流比等参数,得到分析鱼油样品中EPA、DHA的最佳参数条件。

1.2.4 目标峰与其相邻峰分离度的计算 分离度又称分辨率,表示相邻两峰的分离程度,用R表示。R越大,表明相邻两组分分离越好。当R<1时,表明相邻两峰有部分重叠;当R=1.0时,表明相邻两峰基本分离;当R=1.5时,表明相邻两峰已完全分离。R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比,计算公式如下:

R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)

式(1)

式中:tR2-相邻两峰中后一峰的保留时间;tR1-相邻两峰中前一峰的保留时间;W1、W2-相邻两峰的峰宽。

1.2.5 升温程序对EPA、DHA色谱峰分离度的影响 色谱柱的可承受温度范围为330～350 ℃,而鱼油中大部分脂肪酸在240～260 ℃即可挥发,但为防止少数未挥发物质污染色谱柱,使色谱柱温度升至300 ℃。以超声波辅助溶剂萃取获得的鱼油作为分析样品,分流比10∶1条件下,考察不同升温程序对EPA、DHA色谱峰及其相邻峰分离度的影响,见表1。

1.2.6 分流比对EPA、DHA色谱峰分离度的影响 本实验采用毛细管色谱柱,为了防止毛细管柱超载,须采用分流模式进样,在进样量为1 μL,采用升温程序Ⅳ的条件下,以超声波辅助溶剂萃取获得的鱼油作为分析样品,分别考察分流比5∶1(Ⅰ)、10∶1(Ⅱ)、15∶1(Ⅲ)、20∶1(Ⅳ)对EPA、DHA与其相邻峰分离度的影响。

1.2.7 不同萃取方法获得鱼油的EPA、DHA定量分析 用异辛烷稀释EPA、DHA标准品成适当浓度,做GC分析,分析条件采用目标峰分离度最大时的色谱柱升温程序和进样分流比,根据色谱分析结果,分别确定EPA、DHA色谱峰的保留时间,并将不同浓度的EPA、DHA标准品溶液的浓度与对应色谱峰峰面积做标准曲线,获得标准方程,利用外标法定量分析超声强化亚临界水、超声波辅助溶剂、中性蛋白酶水解和超临界CO2法萃取获得鱼油样品中的EPA和DHA。计算公式如下:

C样品=(V溶剂×C0×Ax)/(A0×Mx)

式(2)

式中:C样品-鱼油样品中目标物质(EPA/DHA)的浓度(mg/g);V溶剂-鱼油样品甲酯化后的溶剂体积(mL);C0-标准品(EPA/DHA)的浓度(mg/mL);Ax-鱼油样品中目标物质(EPA/DHA)对应色谱峰的峰面积;A0-标准品(EPA/DHA)对应色谱峰的峰面积;Mx-鱼油样品的质量(g)。

1.2.8 实验数据的统计学分析 实验获得数据均为三次平行测定数据的算术平均值,利用Excel 2013软件进行数据的误差分析,并采用邓肯多重比较法(Duncan’smultiple range test)对数据进行显著性差异分析。

2 结果与讨论

2.1 升温程序对EPA、DHA色谱峰分离度的影响

色谱柱升温程序的建立依据是:鱼油样品内脂肪酸甲酯及目标物质EPA、DHA甲酯的沸点、色谱柱的最高使用温度范围及目标物质色谱峰与其相邻峰的分离效果。色谱柱升温程序对目标峰分离度的影响见图1和表2。

图1 色谱柱升温程序对目标峰分离度的影响

表2 升温程序对目标峰分离度的影响

在最佳色谱分析条件下,利用标准品色谱图确定的EPA的出峰时间是10.015 min,DHA的出峰时间是16.500 min,由此确定鱼油样品色谱图中出峰时间最接近的峰作为目标峰，进行分离度的计算,为便于观察,各谱图中EPA和DHA对应的色谱峰已用圆圈进行标注。改变升温程序旨在通过改变色谱柱升温速率以及在不同温度范围停留的时间达到促进脂肪酸物质相互分离、提高目标物质响应度和回收率的目的。升温程序Ⅰ和Ⅱ虽然能够实现对EPA(R1均>1.5)的快速分离检测,但DHA的响应值很小，未能检出。Ⅲ和Ⅳ均能检出EPA和DHA,且响应值和分离度都能达到分析检测要求,但在Ⅳ的条件下,EPA分离度更高,DHA的响应度更高,因此综合考虑选择升温程序Ⅳ作为分析鱼油中EPA、DHA的最佳分析条件。

2.2 分流比对EPA、DHA色谱峰分离度的影响

如图2和表3所示,分流比对目标峰分离度有显著影响(p=0.0375<0.05),四种分流比条件下,EPA的分离度均大于1.5,其中,分流比Ⅱ的R1最大,EPA的分离效果最佳。DHA的分子量较大,分子链更长,挥发性较低,不仅出峰时间晚,而且在温度较低的条件下，响应值很低,是探索气相色谱快速分析鱼油组分的限制性成分。除分流比Ⅰ外,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的R2均大于1.5,其中Ⅲ的R2最大,但综合考虑DHA的响应度、峰面积百分比等分析效果,确定的最佳分流比条件是Ⅱ。

图2 分流比对目标峰分离度的影响

表3 分流比对EPA、DHA色谱峰分离度的影响

2.3 不同萃取方法对鱼油中EPA、DHA含量的影响

不同萃取方法分离富集鱼油的原理不同、条件不同,也就意味着获得鱼油的萃取率和鱼油内的主要生理活性组分EPA、DHA的含量有所差别。如图3和表4所示,超声强化亚临界水对鱼油的萃取率最高,达到13.97%,鱼油中的EPA、DHA含量相较于其它三种方法最高,分别达到54.67 mg/g和134.01 mg/g。这是因为超声波在亚临界水内产生的物理效应联合亚临界水的水热液化效应，对鱼胃组织构造的破坏程度最大,鱼胃基质蛋白发生水解,空间网格结构遭到彻底破坏,原本束缚在网格内的鱼油液滴得以充分释放到亚临界水中,被充分溶解富集。酶解法的鱼油萃取率和活性物质含量仅次于超声强化亚临界水,这是蛋白酶水解破坏基质蛋白肽键的结果,但其酶解时间较长,酶活性难以维持在活跃水平。超声辅助溶剂萃取和超临界CO2的鱼油萃取率较低,这两种传统技术未能有效破坏鱼胃颗粒的组织构造,萃取效率完全取决于溶剂对鱼胃颗粒的渗透性及对目标物质的溶解性。

表4 不同提取方法获得鱼油的萃取率及活性物质含量

图3 不同萃取方法获得鱼油的气相色谱图

文中所有实验数据均为三次平行测定数据的平均值。利用Excel对数据进行方差分析，获得每组数据的平方和SS、均方MS、F值、p值、根据p值大小可知，相对标准偏差RSD<5%考察的色谱柱升温程序(p=0.0193<0.05)、进样分流比对目标物质色谱峰分离度有显著影响(p=0.0375<0.05),不同萃取方法对鱼油样品中EPA、DHA的含量会产生极显著影响(p=9.5e-5<0.01)。

3 结论

色谱柱升温程序和进样分流比对鱼油中EPA、DHA目标色谱峰的分离度有显著影响(p<0.05),实验确定的最佳GC分析条件是:色谱柱(Rtx-5,30×0.25 mm,0.25 μm);进样器温度300 ℃;FID检测器温度320 ℃;燃烧气氢气流量30 mL/min;空气流量300 mL/min;进样量1 μL,分流比10∶1;色谱柱升温程序:初始温度100 ℃,保持 2 min;以100 ℃/min升温至230 ℃,保持2 min;以10 ℃/min升温至240 ℃,保持4 min;以5 ℃/min升温至250 ℃,保持1 min;以5 ℃/min升温至260 ℃,保持2 min;以40 ℃/min升温至300 ℃。在该分析条件下,得到的EPA的出峰时间是10.015 min,DHA的出峰时间是16.500 min。该法与国标GB5009.168-2016中的脂肪酸色谱分析方法相比,具有针对性强(可快速检测EPA、DHA)、准确性高、重现性好和快速高效的特点,样品分析时间由82 min缩短至18 min。在最佳分析条件下,超声强化亚临界水萃取法、超声波辅助溶剂萃取法、酶解提取法和超临界CO2萃取法获得鱼油中含有的EPA的检出量依次是54.67、35.23、40.13、33.40 mg/g,DHA的检出量依次是134.01、77.50、102.30、67.31 mg/g。