张春燕,吴美儒,周毅峰,唐巧玉,*

(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室,湖北民族学院,湖北恩施 445000;2.生物科学与技术学院,湖北民族学院,湖北恩施 445000)

莼菜(Braseniaschreberi)别名蹄草、水葵、露蔡、湖菜等,为睡莲科莼菜属中的栽培种,是一种多年生宿根水生草本蔬菜[1]。莼菜含有酸性多糖、蛋白质、氨基酸和维生素等化学成分,有抗肿瘤、抗溃疡、抗菌消炎和促进免疫等生物活性,具有营养、医疗和保健功效,为重要的野生经济植物[2]。

已有的研究表明,莼菜多糖具有降血糖、降血脂作用[3-5],对莼菜多糖结构及功能性的深入研究有利于合理开发利用莼菜。因此,对于莼菜多糖的提取、分离和纯化具有重要意义。莼菜粗多糖的提取工艺已有研究[6-7],而要得到有一定纯度的多糖,首先需要通过初步分离纯化除去共存的色素、蛋白等杂质。多糖分离纯化有多种方法,大孔树脂法是一种常用的初步分离纯化方法,具有稳定性高、吸附容量大、适用范围广、再生处理方便等诸多优点,因而被广泛用于天然产物的分离纯化[8-10]。目前,针对莼菜多糖进行大孔树脂脱色的优化实验尚未见报道。

本文首先对不同类型的离子交换树脂和吸附树脂对莼菜多糖溶液脱色效果进行了考察,然后研究具有较好脱色效果的树脂对莼菜多糖的脱色工艺条件,拟找出能够生产高纯度莼菜多糖的工艺,为莼菜多糖的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莼菜 湖北利川,经脱胶[11]、60 ℃烘干、粉碎后过60目筛,即为莼菜粉,备用;大孔阴离子交换树脂D301-G、大孔阳离子交换树脂001×7、大孔吸附树脂X-5、AB-8、NKA-9、NKA 天津南开大学化工厂;牛血清白蛋白(生化试剂) 南京奥生化学技术有限公司;考马斯亮蓝(G-250) 上海化学试剂公司;蒽酮、浓硫酸、氢氧化钠、葡萄糖、盐酸、95%乙醇 均为国产分析纯。

HZS-H水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;PHSJ-4A酸度计 上海雷磁仪器厂;TU-1810紫外/可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;PH-030A数显恒温干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;ALPHA1-4真空冷冻干燥机 德国Marin Chris公司。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂的预处理 称取5.000 g阴离子交换树脂D301-G,用去离子水反复洗涤直至无泡沫为止,然后用5%盐酸浸泡4 h,再用去离子水冲洗至中性,最后5% NaOH浸泡4 h,去离子水冲洗至pH8.0;称取5.000 g阳离子交换树脂001×7,用去离子水反复洗涤直至无泡沫为止,然后用5% NaOH浸泡4 h,再用去离子水冲洗至中性,最后用5% HCl浸泡4 h,去离子水冲洗至pH8.0;称取5.000 g吸附树脂X-5、AB-8,NKA-9、NKA,用5% HCl浸泡4 h,蒸馏水冲洗至pH6.0,然后用5% NaOH浸泡4 h,去离子水冲洗至pH8.0,最后用95%乙醇浸泡12 h蒸馏水清洗备用[12]。

1.2.2 莼菜多糖的提取 莼菜粉经95%乙醇预处理脱去部分色素后,用55 ℃热水搅拌浸提2 h,5000 r/min离心10 min,上清液用旋转蒸发器55 ℃减压浓缩,得到的浓缩粗多糖溶液用3倍体积95%乙醇沉淀,5000 r/min离心10 min收集沉淀,并进行冷冻干燥(-80 ℃)得到粗多糖,溶解备用。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 树脂的筛选 分别向不同的三角瓶中加入1.0 g D301-G、001X7、X-5、AB-8,NKA-9、NKA树脂,再加入10 mL pH5.0的莼菜多糖溶液,用55 ℃的恒温振荡水浴振荡2 h后过滤,测定各种树脂对莼菜多糖脱色率、蛋白质去除率和多糖保留率的影响。

1.2.3.2 pH对树脂脱色效果的影晌 分别向不同的三角瓶中加入1.0 g D301-G、AB-8、NKA-9树脂,再加入10 mL pH为4、5、6、7和8的莼菜多糖溶液,用55 ℃恒温振荡水浴振荡2h后过滤,测定不同树脂在不同pH条件下对莼菜多糖脱色率的影响。

1.2.3.3 脱色温度对树脂脱色效果的影晌 分别向不同的三角瓶中加入1.0 g D301-G、AB-8、NKA-9树脂,再加入10 mL pH为5.0的莼菜多糖溶液,在30、40、50、60、70 ℃恒温振荡水浴振荡2h后过滤,测定不同树脂在不同温度下对莼菜多糖脱色率的影响。

1.2.4 正交设计确定脱色的最佳工艺条件 在单因素实验基础上,采用正交实验法确定茶多糖提取液的最佳脱色条件,按照四因素三水平L9(34)正交设计,见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 多糖含量的测定 采用蒽酮硫酸法[13]。取2 mL多糖溶液,加入8 mL 2 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液,混匀,沸水浴中加热15 min,自来水冷却至室温,以蒸馏水代替多糖做空白参比,在625 nm波长处测定吸光度,通过标准曲线得到溶液的多糖含量。

1.2.6 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰G-250法[14]。取1 mL多糖溶液,加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液,混匀,以蒸馏水代替多糖溶液做空白参比,在595 nm波长处测定吸光度,通过标准曲线得到溶液的蛋白质含量。

1.2.7 相关指标的计算

多糖保留率(%)=CF×100/CB(CB、CF分别为脱色前、脱色后的多糖含量)

蛋白质去除率(%)=(CB-CF)×100/CF(CB、CF分别为脱色前、脱色后的蛋白质含量)

脱色率(%)=(OD420B-OD420F)×100/ODF(OD420B、OD420F分别为脱色前、脱色后溶液在420 nm处的光密度值)

1.3 数据处理

所有数据均为3次平行实验的平均值,实验数据以均值±标准偏差(Mean±SD)的形式表示,应用Microsoft office excel 2007对实验数据进行分析作图,SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 树脂的初筛选

从脱色率分析结果来看(表2～表3),在α=0.05的精度水平上,六种树脂处理组间F值大于F临界值,证明树脂对莼菜多糖溶液脱色率有显著的影响(p<0.05)。从各处理脱色率平均数分析来看,树脂001×7与树脂D301-G、AB-8、NKA-9、NKA、X-5对莼菜多糖溶液脱色率有显著性差异(p<0.05),而树脂D301-G、AB-8、NKA-9、NKA、X-5之间对莼菜多糖溶液脱色率并无显著性差异(p>0.05),并且D301-G、AB-8、NKA-9三种树脂对莼菜多糖溶液脱色率均达到了60%以上,其中NKA-9对莼菜多糖溶液脱色率达到最大值70.19%。

表2 脱色率的平均数分析(n=3,α=0.05)

表3 脱色率的方差分析(n=3,α=0.05)

从多糖保留率的方差分析来看(表4～表5),在α=0.01的精度水平上,六种树脂处理组间F值远远大于F临界值,p值为5×10-6,证明树脂对莼菜多糖保留率有极显著的影响(p<0.01)。从各处理多糖保留率的平均数分析来看,001×7与X-5、D301-G、AB-8、NKA-9、NKA对莼菜多糖保留率有极显著性差异(p<0.01),D301-G、AB-8、NKA-9、NKA对莼菜多糖保留率并无极显著性差异(p>0.01),其中001×7对莼菜多糖保留率达到最大值59.35%。

表4 多糖保留率的平均数分析(n=3,α=0.01)

表5 多糖保留率的方差分析(n=3,α=0.01)

从蛋白质去除率的方差分析来看(表6～表7),在α=0.01的精度水平上,六种树脂处理组间F值远远大于F临界值,p值为7.68×10-5,证明树脂对莼菜多糖溶液中蛋白质去除率有极显著的影响(p<0.01)。从各处理蛋白质去除率平均数分析来看,树脂001×7与树脂D301-G、AB-8、NKA-9、NKA、X-5对莼菜多糖溶液蛋白质去除率有极显著性差异(p<0.01),D301-G、AB-8、NKA-9、X-5对莼菜多糖溶液蛋白质去除率并无极显著性差异(p>0.01),并且D301-G、AB-8、NKA-9、X-5蛋白质去除率均达到50%以上,其中AB-8对莼菜多糖溶液中蛋白质去除率达到最大值63.7%。

表6 蛋白质去除率的平均数分析(n=3,α=0.01)

表7 蛋白质去除率的方差分析

从脱色率、蛋白质去除率、多糖保留率三个方面综合考虑,筛选出D301-G、AB-8、NKA-9三种树脂进行后续实验研究。

2.2 pH对脱色效果的影晌

从图1可以看出,树脂种类不同,脱色的最适pH也不同。pH为4～8时,D301-G和NKA-9对多糖溶液的脱色率随着pH的增大呈先上升后下降趋势,均在pH=6左右达到较佳脱色效果;AB-8对多糖溶液的脱色率随着pH的增大逐渐下降。总的来说,三种树脂对莼菜多糖的脱色效果在酸性条件下比较好。综合考虑pH对三种不同树脂脱色效果的影响,选择pH为4～6作为正交实验的pH研究范围。

图1 pH对脱色效果的影响

2.3 温度对脱色效果的影晌

由图2可以看出,温度对脱色率的影响较明显。温度在30～70 ℃时,随着温度的增大,NKA-9、AB-8对多糖溶液的脱色率都呈先上升后下降趋势,当温度在一定范围内升高时,由于分子的扩散速度加快,多糖溶液的粘度下降,色素更易与树脂吸附表面结合,但温度超过一定范围(>50 ℃),因色素与树脂吸附作用力较弱,解吸也会加快,导致脱色率下降,D301-G对多糖溶液的脱色率30～60 ℃之间呈平稳上升趋势。因在50 ℃左右温度条件下,三种树脂的脱色效果都较好,故选择45～55 ℃作为正交实验的温度范围。

图2 温度对脱色效果的影响

2.4 正交实验确定脱色的最佳工艺条件

从正交实验和极差分析表(表8)可看出，由R值可知,对脱色率来说,树脂种类影响最大,温度的影响次之,pH影响最小,这与莼菜多糖溶液中色素分子所带的电荷、疏水性、极性、是否容易与吸附树脂的表面基团形成氢键等有关。对多糖保留率来说,树脂种类影响最大,pH的影响次之,温度影响最小,这可能与莼菜多糖大多是碱溶性的酸性多糖有关。对蛋白质去除率来说,温度的影响较大,树脂的种类次之,pH影响最小,这与进行树脂种类筛选时测定的蛋白质去除率相一致。由k值大小可知,以主要考察指标脱色率进行衡量,优化工艺组合为A2B1C3。采用优化工艺组合A2B1C3即树脂选用NKA-9、脱色pH为4和脱色温度55 ℃对莼菜多糖脱色,得到多糖脱色率为79.22%,多糖保留率为67.54%,蛋白质去除率55.75%,优于正交实验脱色最高组合A2B2C3。

表8 莼菜多糖溶液脱色正交实验结果

3 结论

通过正交实验工艺优化,得到了莼菜多糖大孔树脂脱色的最佳工艺。采用NKA-9树脂,在脱色温度为55 ℃和脱色pH为4的条件下,莼菜多糖溶液的脱色率为79.22%,多糖保留率为67.54%,蛋白质去除率为55.75%,莼菜多糖得到了初步纯化,可采用离子交换层析和凝胶过滤层析对其进行进一步纯化。