李 霞,熊 峰,覃献杏,李家树,崔萌佳,郝再彬,陈慧英,*

(1.广西电磁化学功能物质重点实验室,广西桂林 541004;2.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西桂林 541004;3.桂林万禾农产品有限公司,广西桂林 541000)

西番莲(PassifloraedulisSims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)草质藤本植物,其果实又称百香果、鸡蛋果,广泛种植于热带和亚热带地区。我国约有19种,现主要栽培于广西、广东、海南、福建、云南、台湾等地区[1]。西番莲果汁富含人体所需的氨基酸、多种维生素和β-类胡萝卜素以及各种微量元素[2],其果皮也含有丰富的多糖、萜烯类、黄酮类、花色苷、膳食纤维和生物碱[3-5]。近年来,研究表明西番莲果皮多糖具有多种生物活性,如抗肿瘤、抗氧化和调节血糖血脂等作用[6-8]。西番莲常取其果汁用于饮料、糖果等加工,而果皮作为废弃物(果皮约占鲜果重60%左右),既造成资源大量的浪费,也污染环境。可资源化利用西番莲果皮不仅有助于推动西番莲种植和加工产业发展,也将产生巨大的经济效益和社会效益。

微波辅助提取技术具有受热均匀、快速、高速、安全和节能等优点,已被广泛用于芦荟皮、香蕉皮、橘皮和仙人掌皮等多糖的提取[9-12]。目前已有微波辅助提取西番莲果皮中果胶多糖的报道[13-14]。本研究拟考察料液比、提取时间、微波功率等因素对西番莲果皮多糖提取率的影响,并采用响应面法优化其提取工艺,在此基础之上对得到的多糖进行体外抗氧化活性分析,为西番莲果皮资源的综合利用和开发提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西番莲果皮 桂林万禾农产品有限公司;抗坏血酸(VC) 分析纯,广东兴华化学厂有限公司;葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、水杨酸、硫酸亚铁等 分析纯,西陇化工股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 生物试剂,东京化成工业株式会社。

XH-300A电脑微波超声波组合合成/萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司;UV760CRT紫外可见分光光度计 上海傲谱分析仪器有限公司;RE-200A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;BSY-200T型多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司;DL-5-8型离心机 上海安亭科学仪器厂;FD-1B-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微波提取 取新鲜西番莲果皮洗净于50 ℃下烘干,粉碎过20目筛,80%的乙醇85 ℃冷凝回流提取3次,每次2 h,分离残渣并干燥。称取上述残渣5 g,按照一定料液比加入蒸馏水,在一定功率下微波提取一定时间,抽滤,滤液3000 r/min,离心10 min,取上清液旋转蒸发(45～50 ℃)浓缩至挂壁状态,加入4倍体积无水乙醇沉淀,4 ℃静置48 h,4000 r/min,离心15 min,取沉淀冷冻干燥(-60 ℃),得到西番莲果皮粗多糖。

1.2.3 提取工艺的单因素实验

1.2.3.1 料液比对多糖提取率的影响 在微波功率420 W,提取时间3 min,提取1次的条件下,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对西番莲果皮多糖提取率的影响。

1.2.3.2 时间对多糖提取率的影响 在微波功率420 W,料液比1∶30 g/mL,提取1次的条件下,考察提取时间(1、2、3、4、5 min)对西番莲果皮多糖提取率的影响。

1.2.3.3 功率对多糖提取率的影响 在料液比1∶30 g/mL,提取时间3 min,提取1次的条件下,考察微波功率(140、280、420、560、700 W)对西番莲果皮多糖提取率的影响。

1.2.4 提取工艺的响应面优化试验 在单因素实验基础上，以料液比(A)、提取时间(B)、微波功率(C)为自变量,多糖提取率为响应量,设计3因素3水平的响应面优化试验。利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken优化西番莲果皮多糖的提取工艺,实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.2.5 传统水浴提取对西番莲果皮多糖提取率的影响 选取传统水浴提取条件[6],在此基础上设置西番莲果皮多糖提取条件,料液比1∶27 g/mL,在90 ℃水浴锅中浸提120 min,测定多糖提取率,平行3次。

1.2.6 西番莲果皮多糖体外抗氧化活性实验 通过测定西番莲果皮多糖对DPPH、超氧阴离子自由基的清除能力来判断西番莲果皮多糖的抗氧化活性。将VC和粗多糖粉末分别用去离子水配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同浓度。以配制的多糖样品溶液浓度为横坐标,清除率为纵坐标,绘制不同梯度多糖溶液的抗氧化活性曲线。

在高中史料教学中，为了让学生能够对史料内容进行正确了解，就需要学生将史料与作者的立场、人们的观点、社会背景以及所处时代相结合，并围绕教学目的对史料内容进行适当补充。在史料教学中，不仅能够对学生的思维能力与学习能力进行培养与提高，还能够让学生从历史角度对历史事件进行评论。史料的选择应该适合、适量，使其能够与课程内容相平衡，这样才能够有效提高历史教学质量。

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定 量取配制的已知浓度的待测样品液2.0 mL,加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液(无水乙醇作为溶剂),充分混匀后室温下避光反应30 min,在波长517 nm处测定其吸光度Ai,同时测定无水乙醇(2.0 mL)与DPPH(2.0 mL)混合液的吸光度AC,无水乙醇(2.0 mL)和样品液(2.0 mL)混合液的吸光度Aj,在其他条件不变下,以VC替换多糖作为阳性对照[16]。则DPPH自由基清除率计算公式如下:

K(%)=[1-(Ai-Aj)/AC]×100

1.2.6.2 羟基自由基清除能力测定 取1 mL的FeSO4溶液(10 mmol/L)于试管中,加入1 mL的水杨酸-乙醇溶液(10 mmol/L),摇匀后加入1 mL多糖已知浓度的样品液,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL启动反应,37 ℃,水浴1 h,冷却至室温,在波长510 nm测吸光度。在其他条件不变下,以VC替换多糖作为阳性对照[17]。则羟基自由基清除率计算公式如下:

K(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1为蒸馏水代替多糖做空白;A2为样品液;A3为蒸馏水代替H2O2的多糖本底溶液。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件、Origin 8.0软件对单因素实验数据进行作图和统计分析;用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行实验结果分析和自由基清除率IC50计算。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据Bedam Y et al对黄色西番莲果皮果胶多糖进行单糖测定,其主要单糖组成为葡萄糖和木糖[18]。以混合糖绘制的标准曲线方程为y=0.004X+0.075,R2=0.999,在多糖含量为20～100 μg时具有良好的线性关系。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对西番莲果皮多糖提取率的影响 设置料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL,研究料液比对西番莲果皮多糖提取率的影响,结果见图1。多糖提取率随料液比的增大呈现先增大后减小的趋势,在料液比为1∶30 g/mL时，多糖的提取率达到最高,为14.09%。由于料液比增大，导致内部植物细胞和外部溶剂之间的浓度差越大,致使多糖的传质驱动力越大。但当液料比高于1∶30 g/mL后,曲线下降,意味着溶剂与材料比例的进一步增加,不会增加多糖的提取率,这可能是因为溶剂与材料的比例越高,扩散内部组织距离越长,并在传输过程中造成损失。因此,选择微波辅助提取西番莲果皮多糖的料液比为1∶30 g/mL。

图1 料液比对西番莲果皮多糖提取率的影响

2.2.2 提取时间对西番莲果皮多糖提取率的影响 设置提取时间为1、2、3、4、5 min,研究提取时间对西番莲果皮多糖提取率的影响,结果见图2。多糖提取率随提取时间的增大呈现先增大后减小的趋势。长时间提取有助于液体渗入原料的释放介质,溶解多糖并随后从原料中扩散出来。当提取时间达到3 min时,提取率达到最大。继续增加提取时间,导致多糖的降解和蛋白质等杂质的产生而使提取率下降。因此,选择微波辅助提取西番莲果皮多糖的提取时间为3 min。

图2 提取时间对西番莲果皮多糖提取率的影响

2.2.3 微波功率对西番莲果皮多糖提取率的影响 设置微波功率为140、280、420、560、700 W,研究微波功率对西番莲果皮多糖提取率的影响,结果见图3。多糖提取率随着微波功率的增大呈现先增大后减小的趋势。当微波功率达到420 W时,提取率达到最大。继续提高功率,多糖提取率下降,原因是由于微波功率过大造成温度过高,使部分多糖发生降解。因此,选择微波辅助提取西番莲果皮多糖的微波功率为420 W。

图3 微波功率对西番莲果皮多糖提取率的影响

2.3 响应面优化实验结果

2.3.1 响应面回归模型的建立和分析 在单因素实验基础上,选择料液比(A)、提取时间(B)、微波功率(C)作为影响因素,多糖提取率为响应值Y,根据Box-Behnken设计的实验条件和西番莲果皮多糖提取率如表2所示。

表2 RSM实验设计及结果

西番莲果皮多糖提取率为11.51%～14.15%,对实验数据进行二次多项式回归拟合,得回归方程:Y=14.05-0.25A+0.42B+0.46C-0.02AB+0.05AC-0.84BC-0.43A2-0.25B2-0.55C2。

对数据进行方差分析,结果(表3)显示模型的p<0.0001,表明回归模型显著;失拟项p=0.059>0.05,不显著。回归方程模型相关系数R2=0.991,模型的调整R2=0.979,该模型能够解释97.9%的响应值变化,说明模型与实际实验拟合度较好,实验误差较小,可信度较高，表明该模型能够很好对西番莲果皮多糖的提取率进行分析和预测。由表3可知,回归模型中一次项A、B、C及交互项BC影响极显著(p<0.01),平方项A2、B2、C2均达到极显著水平(p<0.01),由此可见,微波功率、提取时间和料液比对西番莲果皮多糖的提取率都有极显著影响(p<0.01)。由方差分析中各因素的F值大小反映各因素对实验指标的影响程度,各因素对多糖的影响大小依次为:微波功率(C)>提取时间(B)>料液比(A)。

表3 RSM回归模型方差分析结果

料液比、提取时间和微波功率这三个因素两两交互作用的三维响应面与等高线图见图4,A、B和C的二次项系数均为负值,表明方程抛物线开口向下有最大值,即为响应面的最高点,亦为等高线最内椭圆的中心点[19]。等高线的形状也反映交互作用的强弱,等高线越接近于圆形,显著程度越弱,形状越接近于椭圆形,则表示交互作用越显著。通过对响应面陡峭程度分析,微波功率对多糖提取率的影响最大,其次是提取时间和料液比。通过对等高线的分析发现,微波功率和料液比提取时间的等高线为椭圆形,说明这两个因素交互作用显著,而微波功率和料液比的等高线与料液比和提取时间的等高线为圆形,所以微波功率和料液比交互作用不显著,料液比和提取时间交互作用不显著。这与方差分析结果一致。

图4 因素间的交互作用对西番莲果皮多糖提取率影响的响应面图

2.3.2 验证实验 利用Design-Expert 8.0.6软件计算所得西番莲果皮多糖微波提取的最佳条件为:料液比1∶26.87 g/mL,提取时间3.38 min,微波功率406.43 W,在此条件下预测的多糖提取率为14.23%。考虑到实验的可操作性,取料液比1∶27 g/mL,提取时间3.4 min,微波功率420 W,在此条件下平行3次验证实验,多糖提取率为14.12%±0.42%,相对偏差较小且与预测值接近,工艺条件稳定可行。

2.3.3 传统水浴提取与微波辅助提取对多糖提取率的比较 分别在传统水浴提取/微波辅助提取最佳工艺条件下提取西番莲果皮多糖,进行3次平行实验,比较传统水浴提取法与微波辅助提取法对西番莲果皮多糖提取率的影响,结果见表4。

表4 不同提取方法对西番莲果皮多糖提取率影响

由表4可知,在相同的料液比条件下,微波辅助提取多糖提取率是传统水浴提取的1.5倍。由于微波提取具有升温快速、萃取效率高,更能有效破坏细胞壁结构,在短时间内加速西番莲果皮多糖的释放,从而提高多糖的提取率。姜曼[20]采用微波辅助提取玫瑰花多糖提取率是其传统水浴提取1.1倍,而提取时间却为传统水浴时间的1/60。因此,与传统水浴相比,微波辅助提取技术具有明显的省时、高效优点。

2.4 体外抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH自由基清除能力 西番莲果皮多糖对DPPH自由基的清除率见图5。在浓度为0.1～1.0 mg/mL时,西番莲果皮粗多糖对DPPH·的清除能力在浓度范围内呈现一定剂量效应,且随着浓度的增大而提高,但在此浓度(0.1～1.0 mg/mL)范围内,VC对DPPH·的清除率较稳定,均在90%以上。当浓度达到1.0 mg/mL时,西番莲果皮多糖对DPPH·的清除率为74.02%,其IC50值分别为0.374 mg/mL。Silva等[21]对西番莲叶的水提物进行DPPH·清除实验,IC50值为1.1 mg/mL,IC50值越低,其清除效果越好。与西番莲叶的水提物相比,西番莲果皮多糖对DPPH·的清除力相对较强。

图5 西番莲果皮多糖对DPPH·清除作用

2.4.2 羟基自由基清除能力 西番莲果皮多糖对·OH的清除率见图6。西番莲果皮粗多糖对·OH的清除能力随着浓度的增大而提高,当浓度达到1.0 mg/mL时,西番莲果皮多糖清除率为14.41%,其IC50值为61.06 mg/mL。文良娟等[22]采用·OH清除率测定其西番莲果皮水提物的抗氧化活性,当浓度为5.4 mg/mL时,清除率为77.33%,表明在一定浓度范围内,西番莲果皮多糖的浓度与·OH的清除率呈正相关。

图6 西番莲果皮粗多糖对·OH清除作用

3 结论

本研究采用微波辅助提取西番莲果皮中多糖,在单因素实验基础上,通过Box-Behnken实验设计,建立西番莲果皮多糖提取率的二次回归模型,优化最佳工艺条件为:料液比1∶27 g/mL,提取时间3.4 min,微波功率420 W条件下,此条件下的西番莲果皮多糖提取率为14.12%±0.42%。这与响应面模型方程理论值接近,说明该模型能较好地预测实际提取率。此外,通过体外抗氧化实验充分证明了西番莲果皮多糖具有一定的抗氧化活性。在一定浓度范围内,西番莲果皮粗多糖与DPPH·和·OH的清除率存在一定量效关系,当浓度为1.0 mg/mL时,DPPH·和·OH的清除率分别为74.02%和14.41%。可见,微波辅助提取西番莲果皮多糖提取率较高、抗氧化能力较强,不仅具有作为功能成分在食品和医药领域进一步发展应用的潜力,也为资源化利用西番莲果皮提供思路和理论依据。