姜圆圆,赵 岩,*,王士杰,郜玉钢,刘双利,杨 鹤,张连学

(1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118;2.吉林农业科技学院中药学院,吉林吉林 132101)

唇形科薄荷属植物薄荷(MenthahaplocalyxBriq.),又称水益母,为广泛种植的宿根性草本植物;其茎叶具有清凉的芳香气味,沁人心脾;是一种兼具观赏与药用价值的经济作物。作为中药,薄荷疏散风热,清利头目,利咽,透疹,疏肝行气;用于风热感冒,风疹,麻疹,胸胁胀闷等症[1]。薄荷中含有多种萜类、黄酮类、有机酸类等天然成分;此外薄荷富含挥发油——薄荷油,其主要成分为一种单萜类成分——L-薄荷醇(又称薄荷脑),含量可达62%～87%[2];L-薄荷醇具有加强中枢抑制、清凉止痒、利胆、促渗透、消炎止痛等多种药理作用[3]。

癫痫是一种以反复发作为特征的慢性神经性疾病,常伴有认知缺陷和情绪障碍,在人类的全年龄段均具有较高的发病率。由于癫痫发作是大脑中不可控的神经兴奋的结果,所以癫痫一直被认为是神经疾病。据估算,全世界有5000万人患有癫痫,其中85%的病例集中在低收入和中低收入国家[4],大约有20%由于服用抗癫痫药产生严重的副作用,还有约30%的难治性癫痫患者无法获得治疗[5]。在对癫痫发生和发展的研究过程中,产生了新的治疗观点,即以有效地预防癫痫发作为主要治疗目标。癫痫持续状态是一种急重症,可以发生在各种类型的发作形式上,如惊厥性的癫痫持续状态和非惊厥性的癫痫持续状态,其中惊厥性癫痫持续状态可能严重至危及生命[6]。许多抗癫痫药即是试图降低癫痫发作,靶向神经元离子通道、γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸受体一直是消除癫痫发作的主要关注点,常规的抗癫痫剂(苯妥英和卡马西平)和新型的抗癫痫药(加巴喷丁、氨己烯酸和罗雷利唑)具有严重的副作用[7-8]。有30%的患者对这些药物具有耐药性[9]。因此,新的抗惊厥药物的发现以降低癫痫导致的症状显得极为紧迫。

中医药治疗癫痫有着几千年的历史,中医理论认为惊厥属“痫病”,病机与肝的疏泄失常密切相关[10]。《本草述》记载薄荷可治癫痫,去高颠,医治小儿惊狂壮热。薄荷油(主要含L-薄荷醇)通过吸嗅可以调节中枢神经系统中γ-氨基丁酸和谷氨酸类神经递质含量[11]。有研究表明薄荷醇可以调节脑导水管周围灰质(PAG)中GABA受体的突触和突触群体,降低印防己毒素对氯离子通道的影响[12]。但截止目前,尚缺少L-薄荷醇抗癫痫的实验数据及作用机理的相关文献报道。因此,该文对薄荷中的有效成分L-薄荷醇的抗惊厥活性及其潜在的作用机理开展了实验研究,以期为L-薄荷醇药理的开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-薄荷醇(纯度≥99.5%)、卡马西平(纯度≥99%)、戊四唑(纯度≥ 98%) 上海麦克林生化科技有限公司;N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA,纯度≥98%) 美国Sigma公司;磷酸缓冲盐PBS(pH7.2) 上海克隆生物化学制品(北京)有限公司;小鼠γ-氨基丁酸试剂盒、小鼠谷氨酸试剂盒 南京建成生物公司;雄性ICR小鼠,体重18～22 g 由长春市亿斯实验动物科技有限公司提供,生产许可证编号:SCXK(2016-0003),小鼠正常自由进食饮水,室温(25±2) ℃,湿度55%±5%,维持正常昼夜节律。

JA2003J电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;Avanti TM J-3OI冷冻离心机 海南赫敏仪器有限公司;Spectra MAX 190酶标仪 上海美谷分子仪器有限公司;DY89-1电动玻璃匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 L-薄荷醇对抗戊四唑所致小鼠惊厥实验 将50只健康雄性小鼠随机分为5组,每组10只,分别空白组(相同体积的生理盐水)、阳性组卡马西平(80 mg/kg),L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(8 mg/kg)三个剂量组,连续灌胃给药3 d,一天一次。于末次给药60 min后,每组小鼠腹腔注射戊四唑(70 mg/kg)[13],每只小鼠单独放置笼子里观察30 min。以全身阵挛性惊厥为观察指标,以给药后至出现第一次阵挛发作为惊厥潜伏期,以阵挛性发作出现的时间为惊厥持续时间,观察记录30 min内惊厥小鼠的数量、惊厥潜伏期、惊厥持续时间、死亡数量,计算死亡率[14]。

1.2.2 L-薄荷醇对NMDA所致小鼠惊厥实验 将50只健康雄性小鼠随机分为5组,每组10只,分别为空白组(相同体积的生理盐水)、阳性组卡马西平组(80 mg/kg)、L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(8 mg/kg)三个剂量组,连续灌胃给药3 d,一天一次。于末次给药30 min后,每组小鼠腹腔注射NMDA(50 mg/kg)[15],每只小鼠单独放置笼子里观察30 min。以全身阵挛性惊厥为观察指标,以给药后至出现第一次阵挛发作为惊厥潜伏期,以阵挛性发作出现的时间为惊厥持续时间,观察记录30 min内惊厥小鼠的数量、惊厥潜伏期、惊厥持续时间、死亡数量,计算死亡率。

1.2.3 GABA与Glu的测定 行为学实验结束,立即将小鼠断头处死,在冰台上迅速将小鼠脑组织取出,放置于-80 ℃冰箱保存,在测定前,用预冷的生理盐水冲洗脑组织表面血迹,称重,加入9倍体积的冰冷的磷酸盐缓冲溶液PBS(pH7.2),使用匀浆机将脑组织充分匀浆,将组织液置于离心机中4 ℃,12000 r/min离心4 min,取上清液[16]。按照试剂盒说明分别检测上清液中GABA、Glu含量。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 L-薄荷醇对戊四唑所致小鼠惊厥的影响

L-薄荷醇对戊四唑所致惊厥的影响如表1所示,戊四唑可以反映药物的抗惊厥效果,腹腔注射40～100 mg/kg可诱发惊厥[17],与空白对照组比较L-薄荷醇高剂量组(70 mg/kg)可极显著缩短戊四唑所致小鼠惊厥持续时间(p<0.01),使惊厥潜伏期极显著延长(p<0.01),使死亡率降低到30%,抗惊厥效果优于阳性药卡马西平。L-薄荷醇中剂量组(30 mg/kg)与空白对照组比较可显著缩短惊厥持续时间(p<0.05),延长惊厥潜伏期(p<0.05),减少戊四唑所致惊厥数,使死亡率降低到50%;但L-薄荷醇的低剂量组(8 mg/kg)对戊四唑所致惊厥无抑制效果,对惊厥数量、惊厥潜伏期、惊厥持续时间、死亡率均无显著性影响。实验结果显示L-薄荷醇可抑制戊四唑所致惊厥,且呈一定的剂量依懒性,低剂量的L-薄荷醇对惊厥的发作无明显的抑制作用。戊四唑是通过GABA受体介导引起惊厥,中枢神经系统GABA含量变化与惊厥密不可分。有研究表明L-薄荷醇通过增强GABA能紧张性抑制下调中枢神经元的兴奋性,可以抑制大鼠电刺激所产生的癫痫发作[18]。L-薄荷醇可能是作用于GABA能系统抑制戊四唑诱导的惊厥。

表1 L-薄荷醇对戊四唑所致小鼠惊厥的影响(x±s,n=10)

2.2 L-薄荷醇对NMDA所致小鼠惊厥的影响

如表2所示,与空白对照组比较,L-薄荷醇高剂量组(70 mg/kg)可极显著缩短NMDA所致小鼠惊厥持续时间(p<0.01),使死亡率降低至20%,使惊厥潜伏期延长(p<0.01)。L-薄荷醇中剂量组(30 mg/kg)与空白对照组比较可显著缩短惊厥持续时间(p<0.05),延长惊厥潜伏期(p<0.05),降低死亡率至40%,但对NMDA所致惊厥数无影响。L-薄荷醇的低剂量组(8 mg/kg)对NMDA所致惊厥无抑制效果,对惊厥数量、惊厥潜伏期、惊厥持续时间、死亡率均无影响。惊厥发作的机理表明[19],兴奋性氨基酸谷氨酸与神经元异常兴奋密切相关,NMDA是一种强力外源性致惊剂,作用于谷氨酸NMDA受体,通过阻断NMDA谷氨酸型受体介导的突触兴奋可以抑制惊厥发作。腹腔注射50 mg/kg的NMDA即可诱发惊厥,L-薄荷醇高剂量组(70 mg/kg)与中剂量组(30 mg/kg)对NMDA表现出的抗惊厥效果可能是通过作用于谷氨酸能系统。

2.3 L-薄荷醇对戊四唑所致惊厥小鼠脑内GABA含量的影响

如图1,L-薄荷醇的高剂量组(70 mg/kg)小鼠脑组织中GABA含量与空白对照组比较明显升高,具有极显著差异(p<0.01)。L-薄荷醇中剂量组(30 mg/kg)小鼠脑组织中GABA含量与空白对照组比较具有显著差异(p<0.05),L-薄荷醇的高剂量和中剂量组可以拮抗戊四唑所致小鼠脑内GABA含量的降低。但L-薄荷醇的低剂量组(8 mg/kg)小鼠脑组织中GABA含量与空白组比较无差异性。脑组织中GABA含量降低是神经细胞过度兴奋,过度放电,诱发惊厥的主要原因之一[20]。实验通过对GABA含量的检测,数据结果表明,与空白组比较,L-薄荷醇高剂量(70 mg/kg)与中剂量(30 mg/kg)能增加小鼠脑中GABA的含量,其差异性具有统计学意义。证实L-薄荷醇通过作用在γ-氨基丁酸能系统,拮抗戊四唑诱导惊厥发生。

图1 L-薄荷醇各剂量组对戊四唑所致惊厥小鼠脑内GABA含量的影响

2.4 L-薄荷醇对NMDA所致惊厥小鼠脑内Glu含量的影响

如图2,L-薄荷醇的高剂量组(70 mg/kg)小鼠脑组织中Glu含量与空白对照组比较明显降低,具有极显著差异(p<0.01)。L-薄荷醇中剂量组(30 mg/kg)小鼠脑组织中Glu含量与空白对照组比较具有显著差异(p<0.05),L-薄荷醇的高剂量和中剂量组可以拮抗NMDA所致小鼠脑内Glu含量的升高。但L-薄荷醇的低剂量组(8 mg/kg)小鼠脑组织中Glu含量与空白组比较无差异性。腹腔注射NMDA可增加抑制性氨基酸谷氨酸的含量,诱发惊厥,L-薄荷醇的高剂量组(70 mg/kg),中剂量组(30 mg/kg)极显著(p<0.01)的降低了脑组织中Glu水平,与行为学表现相一致,减低NMDA所致惊厥死亡率,延长惊厥潜伏期,缩短惊厥持续时间,降低惊厥发生次数。

图2 L-薄荷醇各剂量组对NMDA所致惊厥小鼠脑内Glu含量的影响

3 讨论

戊四唑模型是常用的筛选药物抗惊厥作用的方法,戊四唑是GABA受体拮抗剂,通过抑制GABA神经递质引起惊厥[21]。GABA是大脑中枢神经系统中的主要抑制性受体[22],直接和间接地参与大多数脑疾病,包括焦虑障碍、睡眠障碍、情绪障碍、认知障碍、精神分裂症和癫痫症,GABA含量的降低与惊厥有着密不可分的关系[23]。L-薄荷醇高剂量(70 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)可扭转由戊四唑所致GABA含量的降低,有效地抑制惊厥发生数量,缩短惊厥持续时间,减少惊厥死亡率。

谷氨酸是中枢神经系统内兴奋性神经递质,惊厥发生多数是由于兴奋和抑制作用失衡所致,当兴奋因素占明显优势时可诱发癫痫[24]。NMDA是谷氨酸激动剂,系统的腹腔或脑室内给药均可诱发鼠类的运动性癫痫发作[25]。动物实验表明,应用NMDA拮抗剂可抑制癫痫发作,证实惊厥发作与NMDA或其受体的表达有关[26],本实验使用NMDA致惊厥模型评估了L-薄荷醇高剂量(70 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)和低剂量组(8 mg/kg)抗惊厥效果,实验结果表明L-薄荷醇高剂量(70 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)可扭转由NMDA所致Glu含量的升高,有效地抑制惊厥发生数量,缩短惊厥持续时间,减少惊厥死亡率。

4 结论

本实验研究了L-薄荷醇的抗惊厥效果及其发挥抗惊厥作用的相关机制。采用戊四唑、NMDA致惊厥模型,评估L-薄荷醇的抗惊厥效果,结果显示L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)剂量组能对抗戊四唑和NMDA所致的惊厥,有效地抑制惊厥发生数量,缩短惊厥持续时间,延长惊厥潜伏期,降低惊厥死亡率。但低剂量组(8 mg/kg)并未显示出抗惊厥效果,可能是L-薄荷醇抗惊厥作用存在剂量依懒性。中枢神经系统中兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸存在动态平衡,共同调节神经元活动,惊厥的发作与其含量变化极为相关[27-28]。本文通过对惊厥小鼠脑组织中GABA与Glu含量的测定证实L-薄荷醇抗惊厥的作用机制可能与对γ-氨基丁酸系统能和谷氨酸系统能神经系统的调节相关。该研究的成果将为L-薄荷醇药理的开发提供一定的理论基础。有关其成药性、深入的作用机理将在后续实验中开展研究。