赵永昌 柴红梅 陈卫民 赵子悦 孔令舰



羊肚菌子实体发育生物学（上）——生物学和非生物学因子对菌丝培养和子实体形成的影响

赵永昌 柴红梅 陈卫民 赵子悦 孔令舰

（云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650221）

指出羊肚菌具有物种多样性，羊肚菌分类尚存在问题和难点；多方面系统分析羊肚菌生态学，包括环境生态因子（土壤、温度、湿度、光照、氧气和二氧化碳）、营养方式（腐生、菌根）和内生或附着生物体（真菌、细菌、病毒、质粒等）；总结羊肚菌发育生物学研究进展，包括子囊孢子形成与萌发，多变的培养形态，菌核形成与变化，分生孢子，原基形成分化与子实体形成，出菇方式与富营养栽培等。

羊肚菌；物种多样性；生态学；土壤特性；营养方式；发育生物学

羊肚菌营养丰富，含有多种活性和风味物质[1～8]，是世界四大名菌之一。羊肚菌的研究起步较早，除物种学的基本生物学意义之外，早期研究多围绕栽培技术领域展开，而明确物种和生态环境则是栽培的前提。自1982年Ower首次在室内培养出羊肚菌子实体[9]后，研究的重点集中在菌种的培养特性上。虽然美国两家公司Terry Farms Inc.（http://articles.sun-sentinel.com/1994-08-29/business/9408260029_1_mushroom -farm- white-button-terry-cos）和Diversified Natural Products，Inc.(http://msutoday.msu.edu/news/2005/biotech -brings-mushroom-hunt- indoors/）实现了羊肚菌的工厂化栽培，但具体的技术细节和理论依据仍不太清楚，且已不再进行生产。

2002年以来，我国实现了圆叶杨基质的羊肚菌大田栽培和基于营养袋技术的羊肚菌大田栽培，有望在不远的将来种植面积突破10万亩，总产量进入万吨级。我国种植业亩效益过万元的不少，食用菌中平菇是一例，但是其劳动强度较大。表面上看，羊肚菌种植简单，劳动强度小，预期效益高，各级政府纷纷将其作为精准扶贫和脱贫致富的产业来发展。而事实上羊肚菌种植并不简单，纯种植户除个别规模小的收益不错外，整体看并不赚钱，主要原因是产量不稳定。所以，为了羊肚菌产业的健康发展，有必要加强对羊肚菌子实体形成的相关基础生物学的研究。本文结合我们自己的科研工作对近年羊肚菌发育相关的基础生物学研究进展和存在的问题进行系统总结和分析。

1 物种多样性

由于生境对羊肚菌的形态有较大的影响，且形态分类可以用的宏观、微观特征较少，羊肚菌的分类一直是难点。目前记录的种和变种多达334个（www.indexfungorum.org/Names/Names.asp，2018.2.12），多种生物化学和分子生物学的手段已用于羊肚菌的系统分类和物种多样性的研究上[10～21]，多基因系统学方法将羊肚菌分为黄色、黑色、红色三大类群，报道的系统学种有68个（黑色38个，黄色28个，紫褐色2个）[22～29]。分子系统学虽然纠正或弥补了羊肚菌分类上的一些错误和不足，对一部分系统学种进行了描述，并发现了一些新的物种[30～39]，但仍存在以下问题：（1）还有许多系统学种没有被正式描述；（2）系统学种与已发表的形态学种之间的对应关系也未完全确定，一些形态学种是否存在未完全确定；（3）同属之间的物种ITS片段大小差别不大，但羊肚菌三个类群之间的差别较大。产生这些差别的原因不清楚，在系统发育学、分类学上的意义也不明确。分类学上的问题得不到解决，对羊肚菌栽培中的遗传与育种研究影响较大。

2 羊肚菌生态学

2.1 环境生态因子

虽然羊肚菌特别是黄色类群分布区域比较广泛，但一般情况下羊肚菌居群数量较小，发生的时间较短，整体生物量不大，这也是其珍稀名贵的重要原因。影响羊肚菌生长发育的环境生态因子包括植被、气候和土壤，从生物地理学的角度来说，这3个因子相互间密切相关。不少学者对羊肚菌发生的生态环境进行了长期细致的研究[40～48]，得到有益的结果。

2.1.1 土壤

土壤对土生大型真菌的生长发育影响，包括土壤物理化学特性（颗粒度、pH、溶氧能力、持水能力等）、有机无机营养成分（有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、有效硫、钙、镁、铁、锌、钼、锰、硼、铜、硅、钠等）和土壤微生物类群等，一般认为子囊菌发生在中性偏碱性的土壤中，羊肚菌也如此，目前报道的羊肚菌发生区的土壤以pH 6.5～8.5的砂质土壤为主。

（1）pH。在野外调查过程中发现羊肚菌子实体根部1 cm处的pH比10 cm处低0.1～0.3，森林大火之后土壤的pH会上升，pH上升刺激了包括羊肚菌在内的大量子囊菌发生，而这些菌类的发生又促进了土壤的修复与恢复，有利于植物的生长。但是，大田栽培的结果表明，羊肚菌特别是黑色类群对土壤的pH无严格要求，pH 5.0～8.8都能成功栽培出菇。

（2）矿质元素。研究表明，矿质元素影响羊肚菌的菌丝生长速度和菌核形成，栽培中施加微肥还对土壤中微生物群落产生影响，进而影响到栽培的产量和子实体中微量元素、氨基酸的含量[49～51]。赵永昌等对羊肚菌3个产地的土壤进行分析，所测得的各元素含量均在生物生长的临界值以上，而磷、钾、铁、锌、铜、锰、硼和钼则均高出临界值许多，特别是磷、钾和锌，表明羊肚菌对磷、钾和锌有富集作用，而土壤富含有效磷、钾、锌是羊肚菌发生的必要条件[48]。另一特点是，羊肚菌的发生地，铁与镁、锌、铜、锰形成补充和拮抗关系，即镁、锌、铜、锰含量高时，铁含量低；反之亦然。这也许是羊肚菌发生的特定环境要求。羊肚菌发生区土壤微量元素背景值中，锰、铜、锌、铅、镍等元素的全量分布背景值明显高于非羊肚菌发生区。在气候条件适宜的情况下，羊肚菌的产量似与这些元素的全量分布背景值成正相关。

（3）土壤微生物。虽然有研究表明一些种类的真菌和细菌是大型真菌生长发育的助手，但羊肚菌发生区域土壤结构、营养状态差别较大，微生物群落结构更是千差万别。赵永昌等研究指出，羊肚菌发生区细菌及放线菌数量较多但差别小，酵母菌差别较大，而丝状真菌则有镰刀菌属（）、青霉属（）、曲霉属（）、根霉属（）、毛霉属（）等20余种[48]。这些真菌多数为腐生真菌，分解纤维素、木质素等。羊肚菌与微生物之间似没有特定的关系。大田栽培试验表明，未栽培羊肚菌的土壤真菌多样性指数和丰度显著大于羊肚菌根际土，染病羊肚菌根际真菌丰度和多样性大于正常生长的羊肚菌，各样品的群落组成和优势类群有较大差异[52]。圆叶杨栽培点土壤和非栽培点土壤微生物多样性研究发现土壤真菌12种，栽培点和非栽培点在优势真菌种群上有一定的区别，其中盘菌纲真菌群落存在很大的差异；羊肚菌出菇土壤的真菌丰度低于对照，可能与土壤中羊肚菌优势种群对其他种群的抑制作用有关；土壤中细菌包括拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门和变形菌门细菌15种，土壤中细菌的优势种群与是否栽培羊肚菌并无很大关系，栽培土样的优势种群基材目同[53～55]。Singh等研究发现羊肚菌发生区的优势真菌有,sp.，，，和，优势细菌为，，和spp.，出菇点与非出菇点的差别明显[56]。真菌和细菌的相互作用是土壤微生物生态的重要组成部分，目前对羊肚菌与细菌之间的作用研究较少，研究发现可作为细菌的农夫（a bacterial farmer），包括羊肚菌通过生长协助细菌扩散（bacterial dispersal），羊肚菌的分泌物饲喂细菌，帮助细菌进行碳源的收获和转移，同时羊肚菌也是相互作用的受益者，即获取碳源和增加抗性[57]。

（4）大火对土壤特性和羊肚菌发生的影响。虽然世界范围内的采菇者都知道火灾后会产生大量羊肚菌，但很少有人进行定量的研究。Larson等对火灾后Sierra Nevada地区羊肚菌的丰富度进行评估[58]，调查了该区域羊肚菌的时空变化。不同的真菌对火烧强度的反应差别较大，中高强度的火灾后羊肚菌等子囊菌增加100倍以上，这些菌的产生对生态恢复有益[59]。虽然人们也能在没有受到干扰的林地找到羊肚菌，但是在受到火灾、虫害影响而死亡的林地或土壤受到干扰的林地更容易找到。有些管理者使用疏林、烧山的方法增加羊肚菌产出量，这种干扰具有盲目性，而对羊肚菌的多样性、生态等进行深入的研究则较为困难[60]。羊肚菌有时表现出较好的耐温特性，遭受过一定大火的森林土壤会疯长，人们对这一过程中控制子实体发生的生态习性知之甚少。有人观察森林大火后下一季节黑色羊肚菌的生长，采取清理火烧点的树桩、用重型机械压实火烧地土壤并覆盖有羊肚菌发生地木屑的新土等处理，子实体增加较多，而未处理的火烧地只有少量子实体，同一地点未受大火影响的没有发生子实体[61]。通过分析收集的生态信息、遗传数据以及收购者信息发现，火烧后针叶树周边有5种类型的羊肚菌，以灰色羊肚菌较多，而且采菇者确认灰色羊肚菌商业价值高，因为其个大体重，耐储存[62]。

2.1.2 温度

羊肚菌不同种或同种的不同菌株对温度的适应性有差别，室内培养表明，羊肚菌在2～35 ℃都能生长，但形态特征和活力差别较大。目前关于温度对羊肚菌生长发育的影响值得注意的是：（1）耐低温特性。羊肚菌低温耐受性还没有较好的研究，如在新疆伊犁、陕西榆林地区种植后要经过寒冷的冬天，一般温度低于－20 ℃，冻土层在20厘米以上，春季温度回升后羊肚菌即快速出菇。这样的环境条件，冻土层内是否有存活的羊肚菌菌丝体？若有，羊肚菌抗冻的机制是什么？若没有，羊肚菌菌丝体在冻土层形成之前如何靠低氧生长进入非冻土层？（2）耐高温特性。森林大火后的下一季节羊肚菌会大量产生（指春季森林大火后秋季产生，或秋季森林大火后春季产生），火烧地上产生的羊肚菌种源来自何方？虽然Li等研究了不同火烧方式对梯棱羊肚菌种植的影响，认为表面过火可促进羊肚菌生长，增加产量，但这与野生状态过火后大量产生羊肚菌不同，这只是纯粹的改变土壤性质[63]。羊肚菌种植后进行火烧对羊肚菌的影响目前尚无研究，一般的研究者认为羊肚菌种源可能来自空气。若种源真是来自空气，则说明空气中羊肚菌孢子的密度比较高，应该可以监测到，但没有相应的研究结果；若不是，说明羊肚菌能耐受短时间的高温，耐高温的生物学机制是什么？（3）我们利用温湿度记录仪对不同梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌菌株的生长发育温度（1米处空气温度、地表空气温度、土壤10厘米处温度）进行了监测，不同种菌株和同种不同菌株之间存在一定的差别（表1），但不同年份之间也有差别，说明温度对羊肚菌子实体生长发育的影响是多方面的，包括最高温、最低温、积温、温差及同期的湿度等，准确的作用需在可控温的条件下进行研究。

影响羊肚菌生长发育的因素包括生物的和非生物的，而人们对这些因子的了解和认知有限，只有通过持续的研究和观察才能掌握。羊肚菌子实体形成对应于春季土壤和空气温度的转换，而产量与出菇前30天的降雨量密切相关。野生羊肚菌采收期极短（6～7天），出菇期长短与土壤温度关系密切，即只有一个比较窄的出菇土壤温度范围[64]。一般认为黄色和褐色类群属于耐温型，发生周期较长，在以色列从冬季到春季（11月至次年5月）都有发生。有些地区气候适宜，一些品种出菇期也较长，从早春出到中秋[65]，这类种质材料值得研究。调查发现，羊肚菌子实体的发生对应的是土壤逐渐变干[66]。虽然一般情况下羊肚菌以春季出菇为主，但研究表明夏季羊肚菌菌丝体会在土壤中迅速扩张并形成一些特殊的结构储存营养以备下年春季出菇[67]。

2.1.3 湿度

水分是影响食用菌子实体生长发育的重要因子，包括基质含水量和空气湿度。羊肚菌生长发育需要的空气湿度与大多数食用菌基本相同，即80%～95%（表2）。有研究表明，羊肚菌栽培过程中需要重水刺激原基形成[9，68～70]，但是自从使用了覆膜技术，这一理论又受到质疑。一方面使用覆膜技术减少了用水，保湿效果较好，另一方面若出菇前不揭膜可以免去重水催菇。羊肚菌对生长基质水分的需求与多数食用菌不同，其栽培后若水分少则易发生生理病害导致死菇，水分多又易发生病原病害。由于不同种类土壤的持水能力不同，影响水分蒸发量的因素又较多，因此对水分管理要求较高，有必要对羊肚菌生长发育的水分需求进行深入研究。

表1 羊肚菌发育相关温度（℃）

表2 羊肚菌发育相关水分条件

2.1.4 光照

虽然不同种类食用菌原基形成和分化对光照的需求差别较大，但总体上都需要散射光。一般认为羊肚菌喜阴耐湿，光照对羊肚菌生长发育影响的研究较少。有研究表明，羊肚菌菌核的形成与光照时间和强度成反比[71]。目前羊肚菌子实体原基形成有两种形式，一是菌丝在地表聚集逐步发育形成原基，再分化成幼菇[9, 69, 70]；二是在地表下形成原基，长出地表时是幼菇，由于无法定位出菇点，这种情况尚没有报道。多数研究认为，散射光对羊肚菌原基形成和分化有促进作用，强光容易导致幼菇死亡和成菇秃顶。然而，黑白膜大棚、黑白地膜、双层遮阳网的使用结果表明，散射光对原基形成和分化不是必需，光照主要影响菇体的生长速度和颜色，光照弱时子实体颜色浅、成熟期长（图1）。

2.1.5 氧气与二氧化碳

一般认为羊肚菌生长发育消耗氧气，产生二氧化碳，高浓度的二氧化碳可能导致盖小柄长。但二氧化碳和氧气对菌丝生长、菌核形成、分生孢子产生、原基形成和分化的影响研究较少，主要原因还是不可控条件下羊肚菌的生长发育阶段的重复性较差。羊肚菌采取农作物种植的覆膜保水技术，在覆膜条件下羊肚菌生长发育阶段的特点也发生了较大的变化，如分生孢子产生的时间和数量与不覆膜有明显差别，且在覆膜状态下即可产生原基并分化。覆膜与不覆膜在保湿、氧气和二氧化碳浓度上也是有较大差别的，覆膜技术有利于羊肚菌的生长发育，除保湿外，是否与氧气和二氧化碳浓度有关，值得深入研究。

图1 光照对子实体颜色的影响

2.2 营养方式

羊肚菌营养方式的研究起步比较早，早期多数真菌研究者认为羊肚菌是菌根菌，原因是羊肚菌在实验室较难培养出菇，且与特定的树种（榆树、苹果树、杨树等）密切相关[72～75]，而在野外还发现有的品种与植物形成特殊的结构[76]。不可否认的是羊肚菌确实具有较强的腐生能力，能在死亡的树木上快速生长，同时相关的酶学研究也表明其具有分解木质素、纤维素的胞外酶。目前，梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等实现了人工栽培，多数学者认为羊肚菌可能是兼性的，即同时具有腐生和菌根特性。无论是腐生还是菌根目前都有研究和相关的证据，多数证据显示黑色类群菌根多，黄色类群腐生多。但由于生态的差异即使是同一物种，在不同生态下营养方式也有可能不同。

目前，羊肚菌多数种与特定的植物有关系，但没有得到较好的解释，普遍认为多数种与植物的关系是腐生或内生，少数种是纯腐生。羊肚菌发生地主要为相对潮湿的林下和草地，黄色类群主要生长在落叶树下，黑色类群多数生长在针叶树林地或火烧地，而在云南滇西北地区种过中药而荒废的纯草地上也大量出现梯棱羊肚菌。虽然大多数羊肚菌发生在春季，但也有种类只发生在秋冬季。与羊肚菌发生相关的菌根植物种类也是有差异的，且随地理气候的不同差别较大，如同一种羊肚菌在欧洲、美洲和亚洲都有分布。

2.2.1 腐生

羊肚菌营腐生的证据包括了人工栽培、同位素标记及羊肚菌产生各种木质素、纤维素分解酶。不同种类羊肚菌均可产生高活性的漆酶和木质纤维素酶、Mn氧化酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、愈创木酚酶、漆酶等[77～81]。不同类群、不同种和同种不同菌株在产酶活力上有差异，相比黑色类群，黄色类群产生cellulase，amylase，pectinase and urease的活性较高，通过这些酶的活性可以区别是黄色还是黑色类群[82, 83]。不仅不同物种的产酶活力不同，即使是同一子实体的不同单孢，同一菌株的不同发育阶段也有差别。不产菌核菌株的蛋白酶、过氧化氢酶和木聚糖酶的平均活性高于产菌核菌株，而漆酶活性却低于产菌核菌株[84]。除产生与木质素、纤维素降解相关的酶外，羊肚菌还产生与其他碳代谢相关的酶类[85～88]。

对羊肚菌的营养特性研究，不仅局限于传统的生化分析，同位素标记研究表明盘菌目中的真菌Helvellaceae和Tuberaceae是菌根菌，而Discinaceae和Morchellaceae则是腐生菌[89]，Hobbie等确认火灾后产生的羊肚菌是腐生类型[90]，因为木质素降解可产生自发荧光，而研究表明羊肚菌子实体可产生自发荧光[91]。

虽然Kellner等从基因水平上鉴定了羊肚菌种的漆酶基因功能和结构多样性，分类得到15株羊肚菌的漆酶基因，每个菌株都有1种以上的漆酶，并对漆酶的活性进行了研究[92]。但这种研究还不够，其未涉及基因调控和表达水平。相信随着羊肚菌基因组测序完成及各种组学的发展，其腐生特性会得到更深入研究。

2.2.2 菌根

在盘菌类大型真菌中有关于羊肚菌菌根关系的研究[93]，在野外也观察到羊肚菌与多种植物形成菌根关系[94～98]，在成熟的根部形成菌核，而在小根处形成菌根。室内研究表明，营养、物理及生物因子对羊肚菌与挪威云杉（）的菌根形成具有影响，同时羊肚菌菌丝体与一种细菌一起接种在根部时有助于菌根的形成[99]。羊肚菌除与木本植物形成菌根关系外，与禾本科植物也形成类似的关系。研究表明sp.20能与甜玉米形成外生菌根状结构（ectendomycorrhiza-like structures），同时能产生植物激素脱落酸（Abscisic acid）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid）和水杨酸（Salicylic acid），这有益于植物生长和增加抗性[100]。

2.3 内生或附着生物体

开放式生长的大型真菌子实体含有或附着一些其他生物体（真菌、细菌、病毒、质粒等）是比较正常的，这些生物体与大型真菌的关系非常值得研究。其涉及这些生物体是否与大型真菌生长发育相关，是否与食用菌风味物质的产生相关；同时也涉及这些生物体能否产生一些有害物质。Bala等从羊肚菌干品中检测到18个属的37种真菌，包括了,a和等属的多种有害真菌，产生黄曲霉毒素（aflatoxins）、橘霉素（citrinin）、赭曲霉素（ochratoxin）和玉米赤霉醇（zearalenol）[101]。姚丽从羊肚菌子实体中分离得到4种真菌：、、和[55]。沈洪从子实体中检测到拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门内生细菌7种[54]。何培新等从3个地点的粗柄羊肚菌中分离得到内生真菌14种16株，其中15个菌株为子囊菌或其无性型[102]。

羊肚菌子实体上真菌或细菌可能影响羊肚菌生长发育[103]、风味物质产生[101]及食用安全[101, 104～111]。羊肚菌菌肉较薄，生长过程是内外开放的，从子实体上得到的细菌或真菌是内生还是附着比较难界定。目前还没有找到与羊肚菌密切相关的细菌或真菌，而从干品上得到的真菌则更难确定，因为采收后整个过程都有可能附着其他真菌。尽管如此，鉴于近年来羊肚菌栽培的真菌病害比较严重，有些真菌还可能是寄生性的，真菌、细菌与羊肚菌之间的相互作用应引起重视，进行深入研究。

除真菌、细菌外，在羊肚菌菌种上检测到染色体外遗传单元，包括大小各异的质粒，而这些质粒的作用尚不清楚，但明确检测到转录活性[112, 113]，一般质粒或病毒都与寄主的抗性相关，羊肚菌的病毒和质粒研究进展较缓慢。（待续）

国家食用菌产业技术体系（CARS-20）；国家自然科学基金（31460014）

赵永昌（1964—），研究员，从事大型真菌资源收集评价与驯化研究工作。E-mail：yaasmushroom@aliyun.com。

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2095-0934（2018）04-201-06