张昕　任文君

摘 要：为探讨不同持续时间有氧训练对大鼠骨骼肌和血清中NO生成的影响及分子机制，随机把40只雄性SD大鼠分为4组（n=10）：对照组、2周训练组、4周训练组和6周训練组，采用Griess法测定股四头肌和血清NO含量，采用试剂盒测定总一氧化氮合酶（NOS）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性，采用实时定量PCR测定各型一氧化氮合酶及microRNA-24的表达。结果表明：与对照组相比，随着运动时间的增加，实验组骨骼肌和血清中NO含量明显增加，差异显著（P<0.05，P<0.01），在训练第4周达到最大，并且不随训练时间延长而增加；有氧训练后，股四头肌microRNA-24的表达水平显著升高；有氧训练引起cNOS的活性和eNOS mRNA的表达均显著升高（P<0.05，P<0.01），而iNOS的变化不显著。可以认为：有氧运动可通过上调microRNA-24的水平，上调eNOS的表达和活性，从而增加NO生成量。这可能是有氧运动调节eNOS表达的机制之一。

关键词：有氧训练；骨骼肌；NO；NOS；miR-24

中图分类号：G 804.2 学科代码：040302 文献标识码：A

Abstract：To elucidate the effects of aerobic exercise on the production of NO and the mechanism that regulate the expression of NOS，40 male SD rats were separated into control group and training group for 2 weeks， training group for 4 weeks，training group for 6 weeks，n=10. The levels of NO in quadriceps and serum were detected by Griess method，and the activity of NOS in quadriceps was detected by nitrix oxide synthase detection kit，the expression of different types of NOs and microRNA-24 was detected by RT-qPCR. Results： To compare with control group，NO production was elevated significantly in both quadriceps and serum in aerobic exercise groups（p<0.05， p<0.01）and approach the peak point after 4 weeke exercise，and maintained in the same levels even suatained exercise for longer time. Both total NOS and cNOS activity were enhanced in quadriceps，but aerobic exercise had no effects on the activity of iNOS. Aerobic exercise significantly increased the expression of eNOS and microRNA-24（p<0.05， p<0.01）. To sum up，aerobic exercise elevates the production of NO by upregulating the expression of eNOS. In addition，aerobic exercise down-regualtes the expression of microRNA-24， which maybe the reason why aerobic exercise can enhance the activity of eNOS.

Keywords：aerobic training；skeletal muscle； nitric oxide； nitric oxide synthase；miR-24

一氧化氮（NO）是在一氧化氮合酶（NOS）的催化作用下，由L-精氨酸与活性氧分子作用而产生的活性分子。NO 可激活鸟苷酸环化酶，参与血管平滑肌的舒张、抑制血小板凝集、神经传导、炎症反应等多种生理过程[1]。近年来，NO在骨骼肌功能中的作用也受到越来越多的重视。目前已经发现，NO可以通过调节肌肉供氧速度、营养物质可用度、神经体液因素等参与调节骨骼肌的运动功能[2] 。大量研究显示：运动训练，特别是有氧训练，可显著促进骨骼肌产生NO[2]。虽然有氧运动可促进骨骼肌产生NO这些现象已被广泛证实，但是这一现象的分子机制仍不十分清楚，而揭示有氧运动上调NO生成的机制对于建立更科学的运动训练方法、阐明适量运动在医学中的作用很有意义。

microRNA（miRNA）是长约21～25个核苷酸的单链小RNA，它通过与mRNA的3-UTR区结合来抑制mRNA的翻译或者促进其降解，从而负性调控基因的表达[3]。miRNA广泛存在于各种生物体中，它们通常在进化上是保守的，在细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生等多种生物过程中起作用[3]。研究发现microRNA -24在心肌等组织中可以调节内皮一氧化氮合酶（eNOS）的表达[4]，并且microRNA -24参与调节骨骼肌细胞的增殖和迁移，在骨骼肌的损伤修复和收缩等方面具有重要的调节作用。在运动过程中，microRNA -24是否可调节骨骼肌中一氧化氮合酶的活性，仍不明确。

本文研究不同的有氧运动时间对于大鼠股四头肌中NO的水平及microRNA-24的表达影响，为进一步了解有氧运动上调NO生成的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 训练与取材

健康雄性Spraque Dawley（SD）大鼠40只，体质量180～220 g（实验所用大鼠，由西安交通大学医学部实验动物中心提供），自由摄食，适应性喂养1周后，随机分为4组，每组10只大鼠，分组情况见表1。

采用运动强度逐步递增的训练方式进行跑台运动训练，起始速度为15 m/min，时间为20 min，运动负荷参考Bedford的研究[5]。对照组正常笼内饲养，不运动；有氧训练组训练5 d/周，递增速度为3 m/min，时间为5 min，运动至速度为20 m/min，时间为60 min后增加跑台坡度至10%，整个训练过程可用电刺激来强迫大鼠进行跑台训练（电刺激强度小于1 mA）。分别训练2周、4周、6周之后，处死大鼠，分离股四头肌，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 主要试剂

一氧化氮合酶分型试剂盒（南京建成生物技术研究所）；Trizol（Invetrogen公司，美国）；反转录试剂盒（Fermentas公司，美国）；引物由华大生物科技有限公司合成；SYBR Green Master（Roche公司，瑞士）。

1.3 实验方法

1.3.1 一氧化氮测定

取股四头肌制备组织匀浆，用BCA试剂盒测定组织匀浆中蛋白的浓度。采用Grise法测定组织匀浆和血清中一氧化氮含量，即把铬条剪为1 mm边长的正方形，浸泡于0.2 mol/L的HCl活化，随后取200 μL组织匀浆加入80 μL 375 mmol/L ZnSO3，100 μL 275 mmol/LNaOH，120 μL双蒸水，震荡混匀，在1 0 000 g离心30 min，去除蛋白质沉淀，取上清；把干燥的铬粒浸泡于5 mmol/L甘氨酸缓冲液配制的CuSO3，震荡镀铜10 min；取100 μL去蛋白的组织匀浆上清，加入100 μL甘氨缓冲液，150 mg镀铜铬粒，震荡2 h还原NO3-。取等体积10 % N-1-萘乙二胺与1 %磺胺混匀，配制Griess试剂。取96孔酶标板，孔中加入100 μL被还原的组织匀浆上清与等体积的Griess试剂，在室温显色90 min。在544 nm波长测定光吸收。

1.3.2 一氧化氮合酶活力测定

按照南京建成生物技术研究所生产的一氧化氮合酶分型试剂盒测定组织匀浆中总的一氧化氮合酶活力与诱导型一氧化氮合酶活力及组成型一氧化氮合酶活力。

1.3.3 RT-qPCR检测一氧化氮合酶表达

采用Trizol 法提取总 RNA：取重量为100 mg的股四头肌放入1.5 mL的无RNA酶EP管中，加入1 mL trizol，用组织匀浆器进行匀浆，随后加入200 μL氯仿，混匀，在12 000 r/min离心20 min，取上清，加入等体积异丙醇，混匀，在12 000 r/min离心20 min，弃上清，用75 %的乙醇洗涤沉淀，用20 μL DEPC水溶解沉淀，即获得总RNA溶液。用微量核酸蛋白定量仪定量后，取1 μg的总RNA，用olig dT引物反转总mRNA，反转的程序为oligdT引物1 μL，RNA 1 μg，用DEPC水把体积补充到12 μL；65 ℃保温5 min后，立即冷却，随后加10×Buffer 4 μL、dNTPs 2 μL，RNA inhibitor 1 μL，AMV 1 μL，混匀，42 ℃ 作用1 h后，70 ℃ 5 min终止反应。以cDNA 为模板进行RT-qPCR 的扩增，检测内皮一氧化氮合酶（eNOS）、神经一氧化氮合酶（nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平。扩增条件为：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s， 72 ℃ 30 s，45个循环。从美国国立生物技术信息中心的数据库获得人eNOS、nNOS、iNOS及β-actin的mRNA序列，应用软件oligo6.65设计RT-qPCR 扩增的引物，引物序列见表 2。

1.3.4 检测mir-24 的表达

以茎环引物反转 mir-24，取cDNA 2.5 μL，分别加入上下游引物各1 μL，加入SYBR Green 12.5 μL，加入无菌水把体积补充至25 μL。反应条件为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共进行40个循环。以u6作为mir-24表达分析的内参。见表3和表4。

1.4 数据处理

采用 SPSS 13.0 软件进行统计分析。所有数据均以均数±标准差（？字±s）表示。经正态分布和方差齐性检验后，采用单因素方差分析进行多组间比较，以P <0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 肌肉组织匀浆一氧化氮及血清一氧化氮水平的变化

与正常对照组相比，有氧训练组大鼠血清一氧化氮及股四頭肌组织匀浆中一氧化氮的水平显著高于正常对照组大鼠；并且随训练时间的延长进一步升高，在第4周达到最大。此后，即使继续延长训练时间，一氧化氮的水平也不会进一步升高，如图1所示。

2.2 肌肉组织中不同亚型一氧化氮合酶活力的测定

经过有氧训练，股四头肌一氧化氮合酶的活力显著升高。与正常对照组相比，训练2周组的组织匀浆总一氧化氮合酶活性显著升高，并随着训练时间延长活力进一步升高，在训练4周达到最高，即使再进一步延长训练时间到6周，相比训练4周组，训练6周组酶活力没有进一步增加，如图2所示。在训练过程中诱导型一氧化氮合酶的活力没有显著改变；相反，组成型的一氧化氮合酶的活力在有氧训练中显著升高，如图2所示。

2.3 各型一氧化氮合酶在组织中的表达

2周有氧训练后，股四头肌中eNOS的表达水平显著升高，但是随训练时间的延长，eNOS的表达在训练4周达到最高，继续延长训练时间到训练6周不会引起eNOS表达的进一步升高；而iNOS和nNOS表达水平则无显著改变，如图3所示。

2.4 股四头肌中microRNA-24表达水平的改变

与对照组相比，有氧训练后，股四头肌中microRNA-24的表达水平显著升高。但是随训练时间的延长，microRNA-24的表达水平并未进一步升高。训练6周后，microRNA-24的表达与训练4周组无显著的差别。这表明短时间的有氧训练即可引起 microRNA -24的表达升高，在训练4周达到最高水平，并随着运动训练时间的延长而维持在最高水平。如图4所示。

3 讨论

大量研究显示，运动对机体内NO的含量产生影响，NO含量的变化与机体运动量、运动强度、训练水平等相关。运动训练会刺激NOS活性，促使NO及其终产物NOx生成增多。不同的运动强度和时间对NO生成的影响不同。总的来说，长期训练机体生成NO的基础量比不训练的要高，运动员安静时血浆NOx一含量要比普通人高20%～25%[6]。长期运动训练增加骨骼肌NO生成能力主要与长时间中等強度的有氧练习使NOS活性增高有关。一般认为耐力运动主要通过上调NOS的表达引起骨骼肌组织NO生成增加，从而提高骨骼肌的抗疲劳能力和收缩能力[7]。

eNOS是组成型NOS之一，它不仅与心血管的功能有关，也与骨骼肌线粒体的功能及生成有关[8-9]。一般认为，持续的运动训练可以改善运动员的肌群代谢机能，这也是训练可提高运动成绩的原因之一。大量的研究显示，eNOS对肌肉的代谢有重要的调节作用：下调eNOS表达水平可降低氧化磷酸化复合体的功能[10]，并减缓脂肪酸的β-氧化[8]；可上调骨骼肌eNOS表达[11-12]。因此，训练引发的eNOS表达改变可能是训练引发骨骼肌代谢改变的原因之一，也可作为评估肌肉代谢的指标。本研究结果显示，有氧训练2周即可导致eNOS表达升高，而训练4周时eNOS表达升高即达到顶点，即使延长训练时间eNOS表达也不会继续升高。由此可见，有氧训练时应根据肌肉的生理状态，合理安排训练时间，以便取得较好的训练效果，减轻运动员的疲劳。

目前，运动促进骨骼肌eNOS mRNA表达机制的研究主要集中在切应力的调节方面[11-12]。研究者发现多种微小RNA（miRNA）在肌肉活动的调节中发挥了重要的作用，microRNA-24就是其中之一。Sun等[13]发现， microRNA-24可促进成肌细胞的分化，上调肌细胞生成素、α-肌动蛋白和骨骼肌肌球蛋白重链表达，从而促进肌纤维生成。运动训练也可引起肌细胞生成素、α-肌动蛋白和骨骼肌肌球蛋白重链表达上调[14]，这是骨骼肌适应训练而对生理状态的调整。由此可以推测：microRNA-24参与了骨骼肌适应外界训练刺激的过程。

NO生成增加也是骨骼肌适应训练刺激的一个重要机制。而miRNA-24在NO的生成中也发挥了重要的作用，在心肌细胞中可上调eNOS的表达[4]，因此，miRNA-24可能对骨骼肌中NO的生成也会产生影响。本研究的结果也显示，有氧运动可上调miRNA-24表达。结合miRNA-24对eNOS的表达调节，可推测miRNA-24可能通过上调eNOS表达促进NO生成。结果显示，在有氧训练2周即可导致miRNA-24表达升高，而训练4周时miRNA-24表达升高即达到顶点，即使延长训练时间miRNA-24表达也不会继续升高。训练引发的miRNA-24改变与eNOS表达的改变趋势是相同的。由此可见，训练引发的miRNA-24变化很可能是导致骨骼肌eNOS变化的原因。

通过本研究，可以看到有氧运动不仅可影响骨骼肌中NO和NOS的表达，miRNA-24的表达水平也因有氧训练而改变，这表明miRNA-24与骨骼肌适应训练刺激有关。由此，有氧运动可从基因组层次影响肌肉的机能，阐明miRNA-24在骨骼肌中的详细作用通路将有助于理解运动的生理作用。

4 结论

1）有氧训练可提高体内NO 的水平、股四头肌中组成型NOS的活力和eNOS的表达水平；并且在训练4周时，组成型NOS的活力和eNOS的表达达到顶点，即使延长训练时间NOS的活力和eNOS的表达也不会进一步升高。

2）有氧训练可提高股四头肌中miRNA-24的表达水平；并且在训练4周时，组成型miRNA-24的表达达到顶点，即使延长训练时间miRNA-24的表达也不会进一步升高。这2个现象之间的生理逻辑是有氧运动通过上调miRNA-24表达改变肌肉组织中eNOS的表达和活力，进而通过改变体内NO的水平来改变肌肉组织的代谢特点。

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