黄宏兴 柴爽 黄红 万雷 张志海 王吉利

1. 广州中医药大学附属骨伤科医院，广东 广州 510240 2. 广州中医药大学，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少及骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易于发生骨折为特征的全身性骨骼疾病。该病的发生与骨形成和骨吸收失衡密切相关，在骨重建过程中，吸收的骨量多于形成的新骨而造成骨重建脱偶联，是骨质疏松发生的病理基础[1]。过去的研究多关注破骨细胞过度活化，但近年来成骨细胞功能异常在骨质疏松发病中的作用越来越受到重视[2-5]。研究发现，成骨细胞凋亡在骨质疏松症的发病过程中起着非常重要的作用[6]。关于细胞调亡的研究提示Bcl2(B-cell lymphoma-2)蛋白家族是调控细胞线粒体调亡途径的关键因子，Bak1(BCL2-antagonist/killer 1)作为Bcl2家族的促凋亡蛋白，对线粒体凋亡途径中线粒体外膜的通透化非常重要[7]。为进一步研究成骨细胞凋亡在骨质疏松骨形成中的机制，本研究采用Bcl2、Bak1重组腺病毒载体单独或共转染人骨肉瘤细胞MG63，并检测其对细胞及相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞及重组腺病毒载体：人成骨肉瘤细胞(MG63，由中国科学院上海细胞所细胞库提供)、Bcl2、Bak1重组腺病毒载体(本课题组前期已构建)。

1.1.2主要试剂和仪器：DMEM培养基、胎牛血清、Pen/Strep(均购自美国Gibco公司，批号分别为C11995500BT、10099-141、15140-122)，噻唑蓝(MTT)检测试剂盒、Triton-100、EGTA(美国Sigma公司，批号M2128)，碱性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)活性检测试剂盒(上海碧云天生物有限公司，批号P0321)，Calcium Orange TM Indicators(美国Molecular Probes公司)，蛋白酶抑制剂/磷酸化抑制剂、ECL发光液(德国Merck公司)，抗骨桥蛋白(osteopontin，OPN)抗体、抗Runx2抗体、抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)抗体(美国Abcam公司，批号分别为ab91655、ab23981、ab6671)，抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗体(美国Santa公司，批号Sc-25400)，羊抗兔二抗(美国Jackson公司，批号111-035-003)蛋白Marker(美国Fermentasa公司)，细胞培养箱(法国NaPCO公司)酶标仪(美国Thermo公司)，Aria Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)，ChemiDoc MP凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞活性检测：收集对数生长期MG63细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/mL。96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，设置空载腺病毒干预组(A组)、Bcl2重组腺病毒转染组(B组)、Bak1重组腺病毒转染组(C组)、Bcl2、Bak1重组腺病毒共转染组(D组)，每组设置3个复孔。培养24 h后，用Bcl2、Bak1重组腺病毒单独或共转染MG63细胞(MOI=50)。转染48 h后，弃旧培养基后再补充新鲜培养基，并分别向每孔中加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续于细胞培养箱内培养4 h后终止培养，按照试剂盒说明书操作步骤测定各孔吸光度A，根据各组A计算细胞活性：(A实验组/A正常细胞组)×100%。

1.2.2细胞ALP活性检测：收集对数生长期MG63细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL。于6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液，同上分为4组，每组设置3个复孔。常规条件下培养24 h后，用Bcl2、Bak1重组腺病毒单独或共转染MG63细胞(MOI=50)。转染48 h后，弃旧培养基，消化收集细胞，提取细胞总蛋白，12 000 rpm离心30 min，取上清，考马斯亮蓝蛋白定量。按照ALP活性检测试剂盒说明书操作步骤操作，在405 nm或400～415 nm范围内检测各孔吸光度。按照以下公式计算碱性磷酸酶活性：由标准曲线计算的酶活×稀释倍数(2.5)/蛋白浓度(μg/μL)。

1.2.3细胞内钙离子浓度检测：选取对数生长期MG63细胞，以1×105个/孔接种到6孔板中，常规条件下培养24 h后，用Bcl2、Bak1重组腺病毒单独或共转染MG63细胞(MOI=50)。48 h后消化收集细胞，PBS洗涤细胞沉淀3次。取细胞悬液，加入Calcium Orange Indicator(溶于DMSO，浓度为2 mmol/L)至终浓度为10 μmol/L，置细胞培养箱中孵育1 h，上机测定每管细胞悬液样品的荧光强度(Ex/Em 549 nm/576 nm)，记为F值。加入10% Triton-100后再加入1 mmol/L CaCl2，吹打均匀避光孵育10 min，测定荧光值即Fmax。加入20 μL EGTA，吹打均匀后避光孵育10 min，测定荧光值即Fmin。按照公式计算细胞内游离钙离子浓度：[Ca2+]free=Kd×[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。公式中Kd为荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数，Kd=185 nmol/L。

1.2.4细胞成骨相关蛋白检测：收集对数生长期MG63细胞，同1.2.2步骤分组转染培养，48 h后消化收集细胞，加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液裂解30 min，4 ℃，12 000 rpm离心30 min，转移上清到新的预冷的EP管中，-20 ℃保存备用。BSA法测定总蛋白含量。计算含40μg蛋白的溶液体积即为上样量，在蛋白标本中加入适当体积的5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min。进行10% SDS-PAGE凝胶电泳及转膜，加入CTGF、OPN、Runx2、TNF-α抗体，4 ℃孵育过夜。用TBST在室温下脱色摇床上洗3次(每次5 min)后，加入二抗(1∶3000)，室温下孵育30 min。采用ECL法显色，图像处理软件分析各条带的灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，资料满足正态性及方差齐性，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，不满足方差齐性则采用Dunnett’sC检验，以P<0.05判断为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组腺病毒转染对MG63细胞活性的影响

结果显示Bcl2重组腺病毒转染可明显增强细胞活性，Bak1重组腺病毒转染可降低细胞活性(P<0.05)，共转染可增强细胞活性，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组重组腺病毒转染对MG63细胞活性、ALP活性及钙离子浓度的影响Table 1 Comparison of the cell viability, ALP activity and Ca2+ concentration among the groups after MG63 cells being infected with recombinant

注：与A组相比，**P<0.05；与B组相比，##P<0.05；与C组相比，△△P<0.05。

2.2 重组腺病毒转染对ALP活性的影响

重组腺病毒转染后，B组ALP活性升高，C组ALP活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，D组ALP活性虽有升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 重组腺病毒转染对细胞内钙离子浓度的影响

流式检测细胞内钙离子浓度提示与A组相比，B组钙离子浓度降低，C组钙离子浓度升高(P<0.05)，D组钙离子浓度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4 重组腺病毒转染对成骨相关蛋白的影响

与A组比较，B组CTGF、OPN、Runx2蛋白相对表达量均明显升高，TNF-α表达量则降低(P<0.05)，C组各蛋白相对表达趋势与B组相反(P<0.05)，D组CTGF、Runx2相对表达量升高，OPN、TNF-α相对表达量降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。

表2 各组重组腺病毒转染对MG63细胞成骨相关蛋白的影响Table 2 Comparison of the protein expression among the groups after MG63 cells being infected with

注：与A组相比，**P<0.05；与B组相比，##P<0.05；与C组相比，△△P<0.05。

图1 各组重组腺病毒转染对MG63细胞成骨相关蛋白的影响Fig.1 Comparison of the protein expression among the groups after MG63 cells being infected with recombinant adenovirus

3 讨论

Bcl2家族蛋白在调控线粒体途径细胞凋亡中起重要作用，Bak1、Bcl2蛋白均为家族成员，其中Bcl2蛋白位于线粒体外膜、内质网膜和核膜，能够抑制细胞的凋亡，Bak1蛋白是定位于线粒体外膜上的促凋亡蛋白成员[8]。至于促凋亡和抑凋亡Bcl2家族蛋白是如何相互作用来调控线粒体外膜的通透性和细胞色素C释放的，一般认为，在正常情况下，Bak1与Bcl-xl结合而受到抑制，在凋亡刺激诱导下，BH3-only亚家族蛋白被激活并转移到线粒体上，与抑制凋亡蛋白Bcl2/Bcl-xl等相互作用，释放促凋亡蛋白Bax、Bak；或BH3分子直接同Bax/Bak相互作用，在线粒体上形成蛋白孔道，导致细胞色素C从线粒体中释放而诱导发生细胞调亡[9]。最新研究发现，Bax/Bak双缺失的细胞具有完全的细胞死亡机制，棉酚通过诱导Bcl2和Bcl-xl构象变化诱导Bax/Bak非依赖的细胞凋亡[10]，而PAO和二萜类化合物能诱导促凋亡蛋白Bim上调，与发生构象变化的Bcl2相互作用形成蛋白复合体，介导Bax/Bak非依赖的细胞凋亡[11]。

成骨细胞具有活跃的分泌功能，能合成和分泌骨基质中的多种有机成分，对骨生长有重要作用。绝经后骨质疏松患者以及脊髓损伤后骨质疏松动物模型来源的成骨细胞，成骨细胞活力下降[12]。本课题组前期研究亦发现与非骨质疏松者相比，骨质疏松症患者骨骼肌线粒体通透转换孔活性、松质骨Bak1的表达明显升高，Bcl2的表达则明显降低[13-14]，意味着更多促凋亡物质的刺激或通过，更快地诱导细胞凋亡。在此基础上，本课题组构建了Bcl2、Bak1重组腺病毒载体，并分别单独或共转染人骨肉瘤细胞MG63，发现Bcl2重组腺病毒载体转染可增强细胞活性、ALP活性，降低钙离子浓度；Bak1重组腺病毒载体转染可产生相反的作用；共转染后则对MG63细胞活性、ALP活性、钙离子浓度无明显影响。提示过表达Bcl2可通过抑制Bax/Bak的促凋亡作用来抑制细胞凋亡，从而引起细胞活性、ALP活性增强，细胞内钙离子浓度降低。过表达Bak1可通过提高线粒体外膜通透性促进细胞色素C释放来促进细胞凋亡，从而引起降低细胞活性、ALP活性增强，升高细胞内钙离子浓度。当二者共过表达时，虽然Bcl2与Bak1不直接形成聚合体，但Bak1促细胞凋亡作用与Bcl2抑细胞凋亡作用相互抵消，对MG63细胞无明显影响作用。细胞内钙离子浓度可以影响成骨细胞活性功能[15]，当其浓度升高时，可抑制成骨细胞的矿化能力[16]，结合本研究可说明过表达Bcl2可增强成骨细胞活性及钙化能力、延缓成骨细胞凋亡。

OP的发生与成骨细胞主导的骨形成过程和破骨细胞调节的骨吸收过程密切相关，成骨细胞对骨组织的代谢平衡、生长发育和损伤修复起主要作用。其主要功能包括产生胶原纤维和无定形基质形成类骨质，分泌骨钙蛋白、骨粘连蛋白和骨唾液酸蛋白等非胶原蛋白促进骨组织的矿化。成骨细胞表面还存在多种骨吸收刺激因子的受体，并能分泌一些细胞因子，调节骨组织形成和吸收。研究发现转化生长因子β1可诱导成骨细胞中CTGF的表达，并且在其诱导成骨细胞产生胞外基质的过程中，CTGF为其重要的下游调节器[17-18]。OPN是细胞外多功能基质蛋白，在骨改建中多由成骨细胞和破骨细胞分泌，维持骨基质矿化和骨吸收的平衡，介导骨组织细胞与骨基质间的桥接[19]，常作为成骨细胞成熟阶段的特异性标志物之一[20]。Runx2属于runt结构域基因家族成员之一，是调控成骨细胞和破骨细胞的分化促进骨形成的关键调控因子，可通过调控成骨细胞特异性细胞外基质蛋白基因的表达和成骨细胞周期参与成骨细胞的分化过程[21]。TNF-α不仅能直接作用于破骨前体细胞促进其分化，还可通过诱导成骨细胞表达RANKL间接促进破骨细胞分化，而且能增加破骨细胞介导的骨吸收，对成骨细胞功能也有直接影响[22-23]。以上蛋白均与成骨细胞密切相关，本研究结果显示Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞可提高CTGF、Runx2、OPN蛋白的相对表达量，降低TNF-α相对表达量，Bak1重组腺病毒载体转染则可产生相反的作用；共转染后各蛋白相对表达量无显著性改变。提示过表达Bcl2不仅可通过抑制细胞凋亡增强成骨细胞活性及钙化能力，还可影响成骨相关蛋白的表达，具有促成骨效应。

综上，本研究结果提示过表达Bcl2既可增强成骨细胞活性及钙化能力，又可影响成骨相关蛋白的表达，这为通过干预成骨细胞凋亡来影响骨质疏松骨形成提供了实验依据。