李文苑 葸慧荣 高玉海 杨芳芳 陈克明

兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050

航天飞行是人类遇到的最极端的情况之一，宇航员在地球轨道以外的任务将需要长时间在微重力环境下生活和工作。据报道，每位宇航员在太空中损失大约1%的骨密度(bone mineral density，BMD)，这表明宇航员在任务期间或之后可能处于较高的骨折风险。更好地了解由这些因素引起的问题，可以最大限度地降低宇航员骨量丢失，提高骨质量从而帮助宇航员空间飞行顺利[1-4]。

目前，骨质疏松的治疗方法主要以药物为主，但由于抗骨质疏松症药物的副作用及高成本[5-7]，安全无创生物物理刺激对预防和治疗骨质疏松症更有前景。据报道，正弦交变电磁(sinusoidal electromagnetic fields，SEMFs)能够防止大鼠尾吊(hind-limb suspension，HLS)模型中模拟微重力引起的骨丢失[8]。地面上模拟空间微重力导致骨质疏松症最受认可的动物模型之一是后肢悬吊模型。大鼠的尾吊模型可模拟在太空飞行期间生长的大鼠中的骨转换和肌肉变化[9-10]，尾吊模型大大提高了微重力疾病研究的效率。本课题组前期研究发现，50 Hz 1.8 mT SEMFs可有效促进成骨细胞的分化及矿化成熟[11]。因此，本研究选用大鼠尾吊模型模拟空间微重力环境，探究50 Hz 1.8 mT正弦交变电磁场是否能抑制尾吊所致大鼠的骨量丢失，从而为电磁场治疗骨质疏松症的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

双能X线骨密度仪(GE公司，美国)，BX53型正置显微镜(奥林巴斯公司，日本)，AG-X系列台式电子万能试验机(岛津公司，日本)，酶标仪(BioTeK公司，美国)，高分辨率活体显微CT(Micro-CT SkyScan1176，比利时Bruker micro CT 公司)，SP1600硬组织切片机(德国Leica公司)。水合氯醛(天津大茂化学试剂公司，中国)，血清骨钙素(osteocalcin，OC)试剂盒(上海研吉公司，中国)，抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP-5b)试剂盒(IDS Itd公司，英国)。

1.2 实验动物及分组

6周龄SPF级SD雌性大鼠30只，体重(180±10)g，由甘肃省兰州市兽医研究所提供 [许可证号：SCXK(2015-0001)]，实验开始前先训养大鼠1 w，按照体重随机分为3组，每组10只，分别为对照组、HLS组和HLS+SEMFs组。HLS+SEMFs组大鼠采用50 Hz 1.8 mT正弦交变电磁场每天干预1.5 h，期间大鼠仍然保持后肢悬空。大鼠饲养温度(22±2)℃，湿度50%～70%。实验期间大鼠自由进水进食，每周监测一次大鼠体重。

1.3 双能X射线骨密度仪检测大鼠骨密度

尾吊大鼠在50 Hz 1.8 mT 正弦电磁场下治疗4 w后，处死全部大鼠，剥离主要器官固定于10%甲醛溶液中。剥离股骨、胫骨和椎骨，用0.9%NaCl浸泡过的纱布包裹，于-20 ℃保存。检测前将冻存于-20 ℃冰箱中的椎骨和股骨在室温下自发解冻。通过双能X射线吸收测定法检测股骨和椎骨的BMD。

1.4 生物力学检测

椎骨和右侧股骨用浸透了0.9%NaCl溶液的纱布包裹后置于-80 ℃冻存，临用前自然解冻。股骨置于AG-IS型万能试验机上进行三点弯曲测试，跨距14 mm，加载速度10 mm/min，计算机记录载荷变形曲线及最大载荷、弹性模量等。取大鼠第4腰椎骨(L4)用于压缩实验，将椎体两面的椎间盘及软组织切除，用砂纸将椎骨打磨成上下两个面平行的圆柱体，将圆柱体垂直放置于不锈钢平台上，逐渐加载压力，加载速度为2 mm/min，记录载荷变形曲线，获得最大载荷、弹性模量等。

1.5 血清生化指标分析

大鼠麻醉后自腹主动脉抽取血样，静置10 min，5000 r/min离心10 min，取上层血清冻存于-80 ℃中。骨形成指标检测OC，骨吸收指标检测TRACP-5b，均采用丹麦IDS公司生产的试剂盒。按说明书制作各自标准曲线，计算出样品中OC和TRACP-5b的含量，单位分别为ng/mL和U/L。

1.6 Micro-CT分析

将大鼠股骨用显微CT成像后分析，分析区域选在骨骺线下方5 mm处。用显微CT软件对所选区域进行三维重建，得出三维重建效果图及股骨最大纵剖面图。同时对股骨松质骨的骨微结构进行骨形态参数分析，包括BMD、骨表面积比体积(bone surface/ volume，BS/BV)、松质骨体积(bone/tissue volume，BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁离散程度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.7 骨形态计量学指标分析

图2 各组大鼠离体骨密度。A：股骨离体骨密度；B：椎骨离体骨密度Fig.2 Bone mineral density of rats in each group. A：Bone mineral density of the femur；B：Bone mineral density of vertebrae

采用不脱钙骨组织切片法进行骨形态计量学分析[11]。新鲜分离的左侧股骨用4%多聚甲醛固定后，梯度浓度乙醇脱水，过渡至二甲苯中，随后浸入以40%甲基丙烯酸甲酯、10%邻苯二甲酸二丁酯和50%二甲苯配成的1号液，80%甲基丙烯酸甲酯、20%邻苯二甲酸二丁酯配成的2号液，80%甲基丙烯酸甲酯、20%邻苯二甲酸二丁酯和20 g过氧化苯甲酰配成的3号液中各7 d，最后用80%甲基丙烯酸甲酯、20%邻苯二甲酸二丁酯和60 g过氧化苯甲酰配成的4号液包埋。将包埋好的骨组织用LEICA SP1600锯式切片机切成约50 μm的骨片，用502胶水将骨片封固于载玻片上，用1200～2000目砂纸打磨至显微镜下可见的厚度，然后用Van Gilson方法(VG染色)染色。简言之，60 ℃亚甲蓝染色5～8 min，洗涤不褪色，苦味酸品红染色15 min，然后在光学显微镜下观察染色切片，成像静态组织形态计量分析。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th。

1.8 脏器系数分析

大鼠处死后，分离心脏、肝脏、肾脏和肺脏等器官，并将其周围的脂肪组织剥离，称量每个器官的重量。计算器官指数(器官指数=器官重量/大鼠体重×100%)，用10%甲醛溶液固定内脏。将器官石蜡包埋切片，HE染色进行毒理学分析，评价电磁场的副作用。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量数据用均数±标准差表示，不同组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法。每个变量用3组进行测试，每个实验重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体重变化结果

如图1所示，与正常对照组相比，各实验组大鼠体质量差异均无统计学意义(P>0.05)，说明尾吊以及磁场干预对大鼠体质量没有明显的影响。

图1 各组大鼠体重Fig.1 The body weight of each group

2.2 大鼠离体骨密度检测结果

与正常对照组相比，HLS组股骨和椎骨骨密度显著下降(P<0.01，P<0.01)，与HLS组相比，治疗组股骨和椎骨骨密度显著升高(P<0.05，P<0.01)，说明尾吊后大鼠的骨密度明显下降，而1.5 h正弦电磁场治疗对尾吊大鼠骨密度有一定提高。见图2。

2.3 大鼠股骨三点弯曲和椎骨压缩实验结果

与对照组相比，HLS组股骨和椎体的最大载荷和弹性模量值均显著降低(P<0.01)；与HLS相比，HLS+SEMFs组股骨最大载荷值显著升高(P<0.05)，而弹性模量差异无统计学意义(P>0.05)；与HLS相比，HLS+SEMFs组椎骨弹性模量值显著升高(P<0.05)，而最大载荷值差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组大鼠股骨三点弯曲和椎骨压缩实验。A：股骨弹性模量；B：股骨最大载荷值；C：椎骨弹性模量；D：椎骨最大载荷值Fig.3 Three-point femoral flexion and vertebral compression experiment. A: Modulus of elasticity of femur; B: Maximum load value of femur; C: Elastic modulus of vertebra; D: Maximum load value of vertebra

2.4 大鼠血清生化指标结果

图4 各组大鼠血清生化指标比较。A：血清OC含量；B：血清TRACP-5b含量Fig.4 Serum biochemical markers in rats. A：The content of osteocalcin in serum；B：The content of tartrate-resistant acid phosphatase 5b in serum

HLS组和治疗组血清OC(骨形成指标)相比于对照组显著降低(P<0.01，P<0.05)，HLS+SEMFs 组OC值相比于HLS组显著上升(P<0.01)；HLS组血清TRACP-5b浓度相比于对照组明显升高(P<0.01)；与HLS组相比，HLS+SEMFs组TRACP-5b值明显下降(P<0.01)，说明磁场的干预对提高大鼠OC水平和降低TRACP-5b水平均有一定影响。见图4。

2.5 大鼠Micro-CT分析结果

各实验组松质骨骨微结构的显微CT图像如图5所示，与对照组相比，HLS大鼠的股骨显示骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁面积显著降低，分离度升高。SEMFs部分抑制小梁骨微结构的减少，相比HLS组骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁面积显著升高，且分离度下降。如图5B～5G所示，HLS导致骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th(P<0.01)显著降低，BS/BV、Tb.Sp(P<0.01)明显升高。SEMFs治疗明显提高松质骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th(P<0.01，P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp则降低(P<0.01，P<0.05)。此外，对照组与HLS+SEMFs组相比BMD明显升高(P<0.01)。50 Hz 1.8 mT正弦电磁场对大鼠松质骨BMD有明显促进作用。

2.6 大鼠VG染色结果

图5 各组大鼠Micro-CT分析Fig.5 Micro-CT analysis of rats in each group

图6 各组大鼠VG染色及其结果Fig.6 Rat VG staining

4 w HLS大鼠正弦电磁场照射后，如图6 A中VG染色显示，HLS组与对照组相比，骨小梁数量和厚度明显降低，分离度升高，SEMFs治疗与HLS组相比，骨小梁数量和厚度增加，分离程度降低。定量结果显示，对照组和HLS组之间骨小梁数目、骨小梁骨厚度和骨小梁分离度情况差异均有统计学意义(P<0.01)。SEMFs治疗后与对照组相比，骨小梁数量和厚度增加(P<0.01，P<0.05)，分离程度降低(P<0.05)。

2.7 各组大鼠脏器病理学分析结果

HLS组大鼠和正弦治疗组大鼠相比于对照组，脏器系数差异无统计学意义(P>0.05)，病理分析无异常，器官指数差异无统计学意义(P>0.05)，表明电磁场干预无毒副作用，见图7。

3 讨论

宇航员在空间飞行中骨密度明显降低，已被证明会导致骨质疏松症[12]。骨质疏松作为一种威胁人类健康的疾病，如何有效地治疗及预防就变得至关重要。物理电磁法作为一种常用的治疗方法，已被广泛应用于临床治疗各种骨创伤。据报道，电磁场能够在动物模型中改善尾吊引起的骨质疏松症[8]，但是具体的作用机制尚未完全阐明。本研究采用大鼠进行尾吊，这种模型已被证明可以有效地造成大鼠骨质疏松。与失去正常负重活动或长期卧床的人类有相似之处的是，大鼠尾吊之后会破坏骨代谢的平衡，进而导致骨小梁丢失[13-14]，从而增加骨折风险。本实验参考Zhou等[11]在细胞水平筛选出的最佳正弦交变电磁场参数(50 Hz 1.8 mT)对尾吊大鼠进行干预，通过对尾吊大鼠BMD、生物力学、血清生化、Micro-CT和骨组织形态学的研究，探讨其作用机制，为临床治疗失重引起的骨质疏松的病理以及磁场治疗机制提供有力帮助。

实验期间，每周称量大鼠的体重，大鼠体重趋势反映了大鼠在饲养过程中的状况，本实验过程中各组大鼠体重均呈上升趋势，各组间大鼠体重差异无统计学意义，生长状况稳定。BMD作为评价骨强度的指标，通过检测股骨和椎骨离体骨密度能够准确地预测骨折发生的风险[15-16]，尾吊4 w后，与对照组大鼠相比，通过检测可观察到HLS组大鼠BMD显著降低；与HLS组大鼠相比，SEMFs治疗组的大鼠的BMD显著增加。大量实验结果显示，SEMFs可以增加BMD，如股骨和椎骨的BMD。因此，1.5 h 50 Hz 1.8 mT的正弦电磁场可显著提高大鼠的骨密度。骨的生物力学直接反映骨自身强度和韧性，它与骨骼中各种矿质含量和骨密度有关。电磁场可以显著影响股骨和椎骨的骨密度，与此同时，它对于大鼠生物力学也会有一定影响。骨质疏松治疗研究中常用的生物力学指标主要是最大载荷值和弹性模量，它们直观反映大鼠骨骼整体的抗骨折能力。本实验通过股骨和椎骨的生物力学实验发现，SEMFs可以显著增加骨骼的机械强度，抑制骨外在结构的恶化。经过课题组研究表明，SEMFs刺激能够降低HLS大鼠松质骨的机械强度和结构的恶化，从而改善大鼠骨骼的整体生物力学性能。

骨骼能够保持其正常结构和功能完整性，是由于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡。生化指标体现体内的骨代谢水平，客观地反映大鼠的骨吸收和骨形成。长期尾吊干扰大鼠骨代谢的稳态，导致骨形成减少和骨吸收增加[17-18]。实验表明1.5 h 50 Hz 1.8 mT SEMFs干预可以显著促进HLS组大鼠血清OC的分泌，对成骨细胞的生长有明显促进作用。4 w尾吊导致骨吸收的血清标志物TRACP-5b显著增加，SEMFs治疗后对血清中TRACP-5b浓度有适度的抑制作用。因此，实验结果表明，SEMFs具有一定提高成骨细胞形成和抑制破骨细胞形成的调节作用。

Micro-CT常用于骨小梁的研究，可以直观地观察大鼠松质骨骨微结构的变化。在大鼠股骨的Micro-CT观察中，发现HLS大鼠骨小梁骨架结构明显恶化，HLS导致骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低，但是BS/BV、Tb.Sp明显升高。SEMFs干预4 w后能够显著抑制骨小梁微结构的恶化，提高骨质量。课题组的研究结果表明，SEMFs可以通过促进骨形成，部分治疗尾吊大鼠的骨质量减少和骨微结构的恶化。

骨形态计量学指标是对骨微结构的重要评价指标，反映了机体组织形态学的变化。通过观察SEMFs治疗组与HLS组VG染色结果，可以发现骨小梁数量和厚度增加，分离程度低。组织形态学计量结果进一步证实了SEMFs在骨重塑中的调节作用，具有明显的合成代谢和适度的抗再吸收作用。脏器系数是用来评价电磁场对实验大鼠副作用的指标，本实验中各组脏器系数相比于对照组差异均无统计学意义，病理学分析并无异常，说明电磁场对大鼠无毒性影响。

综上所述，与对照组相比，4 w后各组大鼠体重均有增加，生长正常。治疗组大鼠与对照组大鼠相比，通过骨密度、生物力学、血清生化检测、Micro-CT和组织形态测定结果证明，50 Hz 1.8 mT正弦电磁场照射1.5 h可以促进尾吊大鼠的骨骼合成代谢活动，部分提高尾吊大鼠的骨质量、骨微结构和生物力学强度。本课题组的实验更加明确地证明了SEMFs作为一种安全高效的骨质疏松症治疗方式，可以用于空间飞行中宇航员骨量丢失的临床治疗。