乳腺癌是影响全球女性健康最常见的癌症，全球女性乳腺癌发病率和死亡率分别占女性癌症的25%和15%［1］。虽然随着诊疗水平的提高，其发病率和死亡率均有所改善，但肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）的存在及耐药性的发生仍给治疗带来巨大难度［2］。对于复发性乳腺癌，耐药几乎不可避免，因此了解肿瘤耐药的分子机制尤为重要。本研究旨在通过探讨同源盒基因HOXD3表达对乳腺癌细胞恶性生物学行为及耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 收集2006年1月至2008年12月于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院行乳房切除术且病理确诊乳腺癌的组织标本87例。组织标本收集后在液氮中冷冻，并储存于-80℃用于分析。

1.1.2 主要试剂 兔抗人多克隆HOXD3抗体购自美国Santa Cruz公司；兔二抗、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术公司；DMEM培养基、PBS均购自美国Gibco公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；Li⁃pofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学方法 使用常规免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中HOXD3表达。组织蜡块4 μm切片附于载玻片上，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，于柠檬酸中高温高压修复，滴加抗HOXD3抗体，4℃孵育过夜。滴加生物素标记二抗，DAB显色，苏木素复染，甘油凝胶封片。

1.2.2 细胞培养、转染和处理 使用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435。取对数生长期的人乳腺癌细胞，使用无血清DMEM/F12培养基培养7～10天后，光镜下观察细胞球，测量、计数、拍照。从MDA-MB-231 mRNA中扩增HOXD3 cDNA，将其克隆至pcDNA3.1载体中，生成HOXD3过表达质粒。Lipofectamine2000根据说明书用于质粒转染。转染后使用不同剂量顺铂或阿霉素处理乳腺癌细胞，检测其半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。……