周喆 孙威江 唐秀华 陈志丹

摘 要 以紫芽茶树武夷奇种C18-1的一芽二叶为试验材料，采用单因素分析优化茶树花青素总量的提取方法，并分析其不同季节主要生化成分差异。结果表明：溶剂浓度、浸提时间、浸提温度等因素对茶树花青素总量提取均有影响，本研究获得花青素最佳提取方法为：采用3%的盐酸乙醇溶液，在80 ℃条件下回流浸提1 h。水浸出物、咖啡碱、茶多酚、花青素及游离氨基酸含量均随季节不同而呈现不同的变化规律，且季节性差异显著；水浸出物、咖啡碱、游离氨基酸均在春季中含量最高，茶多酚和花青素均在夏季中含量最高。

关键词 紫芽茶树；花青素；提取方法；生化成分

中图分类号 S571.1 文献标识码 A

Abstract One bud with two leaves of C18-1 was selected as the experimental material. A single-factor analysis was adopted to optimize the extraction method of anthocyanin in tea plants. The differences of main biochemical components in different seasons of C18-1 were studied. The results showed that the factors such as solvent type， solvent concentration， extraction time and temperature had significant effects on anthocyanin extraction. In this experiment， the optimum extraction method of anthocyanin is： ethanol solution with 3% hydrochloric acid， reflux extraction 1 hour under 80 ℃. The contents of water extracts， caffeine， tea polyphenols， anthocyanin and free amino acids showed different changes with different seasons， and the seasonal differences were significant. The contents of water extracts， caffeine and free amino acids were the highest in spring， and the contents of tea polyphenols and anthocyanin in summer were the highest.

Key words purple shoots of tea plant； anthocyanin； extraction method； biochemical components

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.009

茶树（Camellia sinensis.（L.） O.Kuntze），为山茶科山茶属茶种植物，属于异花授粉植物。我国茶树种质资源丰富，幼嫩叶片发生紫化是较为常见的现象。紫化茶树近年来因其呈现红紫化新梢和高花青素的保健功效而备受青睐。相关理化研究显示，高花青素是紫化茶树呈“红紫色”的主要原因。随着花青素合成相关的结构基因表达量增加，可促进花青素合成与积累，进而形成了丰富的紫化茶树品

种[1-2]，同时其叶色转变机理及相关保健功能的研究成为热点。花青素作为紫化茶树的特异性成分，在被子植物中含量较多，根据相关介绍，花青素存在于27个科72个属的植物中[3]。花青素作为不可缺少的次生代谢物，又被称之为花色素，是水溶性色素，属类黄酮化合物[4-5]。一般茶叶中的花青素含量占干物质含量的0.01%左右，而在紫化茶树中可以达到0.5%～1.0%[6]。某些茶树品种新梢红紫化程度较高，且主要集中于幼嫩芽叶，成熟叶片含花青素较少。周琼琼等[7]比较了茶树紫芽和成熟绿色叶片的基本生化和成分差异，得出红紫色芽叶中咖啡碱、茶多酚、儿茶素总量都要高于成熟绿色叶片，且呈极显著的差异。红紫色芽叶中类胡萝卜素的含量、叶绿素总量及叶绿素a、b的含量都极显著低于成熟绿色叶片，但是其花青素含量相对于绿色成熟叶片较高。花青素在茶树叶片中主要以3种形式存在，即飞燕草素、矢车菊素、天竺葵素[8]。此外，在酸性条件下可转变成花青素的还有花白素和原花色素（由儿茶素聚合而成）[9-10]。花青素有助于改善人体健康，具有防癌抗癌、保护肝脏、预防阿尔茨海默症、增进视力等功效。近年来，花青素功能性研究取得较大进展，但是茶叶中花青素的利用甚少，花青素提取的研究引起了廣大学者的关注[11]。王秋霜等[12]优化茶叶花青素提取方案，认为花青素提取的最优条件为：80%的乙醇、0.6%的盐酸浓度、料液比1/25、提取3次。陈长应[13]采用高效液相色谱法测定黑绿豆中花青素的主要成分及其含量，色谱柱：250 mm×4.6 mm ZORBAXSB-C18，5 ?m；柱温：室温；流动相：甲醇+水，按甲醇∶水=5∶1（体积比）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 ?L，检测波长：520 nm。黑绿豆中花青素的含量在1.50～13.5 g/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，相对标准偏差为1.25%（N=6），平均回收率达98.4%。该方法简便快速，结果重现性好，定量准确，准确度、精密度高，适用于黑绿豆提取物中花青素的高效液相色谱分析。李智等[14]以山东黄山群体种茶树紫色芽叶为材料，通过筛选流动相、优化洗脱梯度，建立茶树紫色芽叶花青素组分鉴定和含量检测的HPLC分析法，并采用HPLC-DAD-MS/MS联用技术对茶树紫色芽叶中花青素组分进行了分离纯化和结构鉴定，并从提取的花青素粗制品中分离出9个主要色谱峰；运用HPLC-DAD-MS/MS 联用技术，获得了其中7个组分的紫外-可见光谱信息、质谱数据，结合文献资料，初步推测了茶树紫色芽叶花青素中5个主要组分。此外，采用外标法对各组分进行了定量分析，并获得了粗提物，纯度为32%。该方法简便快捷，结果重现性好，可用于茶树紫色芽叶中花青素组分的分析与鉴定，为茶树紫色芽叶的发生机理、高含量花青素茶树品种的选育、花青素单体药理与生物学作用的深入研究和利用提供依据。

鉴于周琼琼等[7]研究紫芽茶树在同一时期幼嫩紫芽和成熟绿叶的生化成分差异，进一步证明了茶树芽叶呈紫色是由其高含量的花青素组分引起的。本实验在其基础上研究紫芽茶树不同季节主要生化成分变化，探究不同季节下生化成分的变化规律，可较全面验证紫芽茶树芽叶紫化是由于花青素积累。并且，本研究在Pang等[15]的方法上进一步优化茶树花青素提取方法，为后续研究茶树花青素提供可行的提取方法，为茶树花青素代谢合成途径奠定基础，为培育高花青素茶树品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供试材料为紫芽茶树武夷奇种C18-1一芽二叶时期，鲜叶原料采自武夷星茶业，每个季节茶样分成3份。采用120 ℃固样，并用球磨机磨碎试样，待测。夏茶取于2016年6月28日，暑茶取于2016年8月28日，秋茶取于2016年9月30日，春茶取于2017年4月6日。

1.1.2 主要仪器与设备 电热恒温水浴锅（常州市人和仪器厂、HWS24型）、紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司、TU-1810）、离心机（上海卢湘仪TDZ5B-WS）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司、SHB-Ⅲ型）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、通风橱、球磨机（FRITSCH Pulverisette 23）、分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司、BSA124S）、超纯水机（Spring-S20）、快速水分测定仪（sartorious）等。

1.1.3 主要药品及试剂 碳酸钠、浓盐酸、乙醇、甲醇、丙酮、水合茚三酮、碱式乙酸铅、浓硫酸、福林酚试剂、没食子酸、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡、谷氨酸等。

1.2 方法

1.2.1 生化成分测定方法 茶叶中水分测定采用快速水分测定仪进行[16]；茶叶中水浸出物测定参照GB/T 8305-2013《茶 水浸出物》进行；茶叶中咖啡碱含量测定参照GB/T 8312-2013《茶 咖啡碱》进行；茶叶中游离氨基酸含量测定参照GB/T 8314-2008《茶 游离氨基酸》总量进行；茶叶中茶多酚含量测定参照GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行。

1.2.2 茶叶中花青素含量测定方法及优化 花青素含量测定方法采用Pang等[15]的方法：准确称取不同季节茶粉各1.000 g，放入圆底烧瓶中，取20 mL的3%盐酸乙醇溶液于圆底烧瓶中，在水浴锅中以60 ℃回流浸提1 h。回流结束后，用3%盐酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的盐酸乙醇溶液作为参比液，分别于530 nm和657 nm的波长下测定吸光值。

花青素的计算方法（OD/g，鲜重）：OD=（OD530-0.25伊OD657）/M。

（1）提取溶剂类型的优化：设置1%盐酸甲醇溶液、1%盐酸乙醇溶液、1%盐酸丙酮溶液进行比较。盐酸浓度为75%，甲醇为分析纯，乙醇浓度为100%，丙酮为分析纯。准确称取1.000 g茶粉9份，放入圆底烧瓶中，再分别加入20 mL的1%盐酸甲醇溶液、1%盐酸乙醇溶液、1%盐酸丙酮溶液，在60 ℃的条件下回流浸提1 h。回流结束后，用相应浓度的不同溶液定容至25 mL。以各自对应的有机溶剂作为参比液，分别于530、657 nm的波长下测定吸光值。

（2）盐酸乙醇浓度的优化：设置1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%等6个浓度的盐酸乙醇溶液进行比较。准确称取1.000 g的茶粉18份，放入圓底烧瓶中，再分别加入20 mL的1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%的盐酸乙醇溶液，在60 ℃的条件下回流浸提1 h。回流结束后，用相应浓度的盐酸乙醇溶液定容至25 mL。以各自对应的有机溶剂作为参比液，分别于530、657 nm的波长下测定吸光值。

（3）浸提时间的优化：设置30、60、90 min等3个不同回流浸提时间进行比较。准确称取1.000 g的茶粉9份，放入圆底烧瓶中，再分别加入20 mL的3%的盐酸乙醇溶液，在60 ℃的条件下分别回流浸提30、60、90 min。回流结束后，用3%的盐酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的盐酸乙醇溶液作为参比液，分别于530、657 nm的波长下测定吸光值。

（4）浸提温度的优化：设置60、70、80、90 ℃等4个不同温度进行比较。准确称取1.000 g的茶粉12份，放入圆底烧瓶中，再分别加入20 mL的3%的盐酸乙醇溶液，在60、70、80、90 ℃的水浴锅分别回流浸提1 h。回流结束后，用3%盐酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的盐酸乙醇溶液作为参比液，分别于530、657 nm的波长下测定吸光值。

（5）不同季节花青素总量的测定：准确称取不同季节的茶粉各1.000 g，放入圆底烧瓶中，取20 mL的3%盐酸乙醇溶液于圆底烧瓶中，在水浴锅中以80 ℃回流浸提1 h。回流结束后，用3%盐酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的盐酸乙醇溶液作为参比液，分别于530、657 nm的波长下测定吸光值。

1.3 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 花青素提取优化实验结果分析

2.1.1 提取溶剂对花青素提取效果的影响 从图1可知，1%盐酸乙醇溶液提取的花青素含量较高，达（1.607 75±0.08） mg/g。

2.1.2 不同盐酸乙醇浓度对花青素提取效果的影响 从图2可知，3%的盐酸乙醇溶液提取的花青素含量最高，达（1.976 75±0.24） mg/g，其次是4.0%的盐酸乙醇溶液，提取量为（1.905 80±0.13）mg/g。

2.1.3 不同提取时间对花青素提取效果的影响 从图3可知，提取时间为60 min时花青素含量最高，为（1.976 75±0.11） mg/g。

小写字母表示不同季节之间存在显著差异（p<0.05）。下同。

2.1.4 不同提取温度对花青素提取效果的影响 从图4可知，4个提取温度下，以温度为80 ℃时花青素的提取量最高，为（2.188 5±0.14）mg/g。

2.2 紫化茶树武夷奇种C18-1花青素含量检测分析

由图5可知，夏季花青素含量最高，为（3.12±0.03）mg/g，秋季花青素含量最低，为（2.09±0.20）mg/g。花青素含量呈秋季<春季<暑季<夏季递增趋势。显著性分析显示，夏、暑季花青素含量变化显著；春、秋季变化不显著，但是，春、秋季与夏、暑季变化呈极显著。

大小写字母表示不同季节之间存在极显著（p<0.01）或显著（p<0.05）差异。

2.3 紫芽茶树武夷奇种C18-1主要生化成分检测分析

2.3.1 水浸出物含量变化分析 由表1可知，武夷奇种C18-1水浸出物含量春季最高，为（49.68±0.30）%；夏季最低，为（45.03±0.18）%。水浸出物含量呈夏季<暑季<秋季<春季递增趋势。显著性分析显示，春季、秋季水浸出物含量变化不显著，但是，春、秋季与夏、暑季比较呈极显著，夏季与秋季水浸出物含量变化也呈极显著。

2.3.2 咖啡碱含量变化分析 由表1可知， 武夷奇种C18-1咖啡碱含量春季最高，为（2.83±0.20）%；夏季最低，为（2.19±0.41）%。咖啡碱含量呈夏季<暑季<秋季<春季递增趋势。显著性分析显示，夏、暑、秋季咖啡碱含量变化不显著，春季与夏、暑季咖啡碱含量变化显著。

2.3.3 游离氨基酸含量变化分析 由表1可知， 武夷奇种C18-1游离氨基酸含量春季最高，为（2.98±0.08）%；夏季最低，为（2.14±0.14）%。游离氨基酸含量呈夏季<暑季<秋季<春季递增趋势。显著性分析显示，夏、暑季变化不显著，春季与秋季变化显著，春、秋季与夏、暑季变化呈极显著。

2.3.4 茶多酚含量变化分析 由表1可知，武夷奇种C18-1茶多酚含量夏季最高，为（23.95±0.10）%；春季最低，为（21.21±0.35）%。茶多酚含量呈春季<秋季<暑季<夏季递增趋势。显著性分析显示，春、秋季变化不显著，但是，春、秋季与夏、暑季变化呈极显著，夏季与暑季变化也呈极显著。

3 讨论

本研究对提取茶树花青素总量的条件进行优化，结果显示，称取1.000 g茶粉溶于20 mL的3%的盐酸乙醇溶液，在80 ℃水浴中进行回流浸提1 h的条件最佳。花青素含有多个羟基，所以选择亲水性溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、稀酸、稀碱等极性较大且能与水互相混溶的有机溶剂较好[17]。虽然盐酸乙醇的稳定性不如盐酸甲醇，但是乙醇作为有机溶剂，安全度高，使用频率高，且提取率较高，溶剂残留较少，同时用盐酸酸化处理能够使其pH值始终维持在一个较低的数值，防止在浸提过程中非酰基化的花青素降解[18]。所以本研究采用盐酸乙醇溶液来提取花青素。

紫芽种质资源中花青素含量相对一般茶叶较高。其产生和累积离不开茶树生长状态及栽培条件。花青素的积累需要较强的光照和较高的气温，故而夏季的花青素含量最高，使芽叶红紫化明显；光照较弱、气温温和的春季和秋季，二者的花青素含量相对较低。因为花青素属于多酚类，与多酚类代谢和糖代谢密切相关。所以花青素含量呈秋季<春季<暑季<夏季递增趋势。

茶叶水浸出物即为茶叶中能被热水溶解的物质[19]，水浸出物的主要成分是水溶性果胶、氨基酸、茶多酚、咖啡堿等[20]。水浸出物含量与茶叶中可溶性物质的量相关，茶汤醇厚与否取决于此。不同季节茶叶水浸出物有极显著的差异，可能是由于春季氮素代谢快，作为含氮化合物的咖啡碱、氨基酸等物质含量高，所以水浸出物含量高。夏季高温、少雨，糖类代谢旺盛，而在此前提下进行了多酚类的代谢。因此夏、暑季茶多酚、可溶性糖的含量较高，但是总水浸出物含量不及春、秋季。水浸出物含量呈夏季<暑季<秋季<春季的递增趋势。

咖啡碱作为可溶性含氮化合物，决定着茶叶的品质。春茶多于夏、暑、秋茶。在正常情况下，光照强度和光照量大，有利于碳代谢，但同时对氮化合物代谢的抑制程度也不同。所以光照适宜有利于氮代谢，可以促进咖啡碱的合成。水分和温度也影响着咖啡碱的合成，春季、秋季光照较弱，温度适宜，水分较充足，咖啡碱含量高；夏、暑季光照强，高温少雨，影响氮代谢的进行，因此咖啡碱含量较低。此外，咖啡碱含量也受施肥条件的影响。咖啡碱含量呈夏季<暑季<秋季<春季的递增趋势。

氨基酸也是茶汤主要的呈味物质之一，其含量高则成茶具有鲜爽的口感、馥郁的香气。游离氨基酸的含量呈夏季<暑季<秋季<春季递增，可能是因为含氮化合物的作用。春季温湿度适宜，光照相对较弱，氮代谢较快，氮肥供给多，茶树含氮量高，且春季水分充足，雨水多，从而使氨基酸含量也升高。由于夏、暑季高温少雨，高光照，蒸腾作用强烈，氮代谢被抑制，氮肥供应量少于春季，且又容易被分解和转化，造成含量低；而到了秋季，光照强度和日照量相较于夏、暑季低，雨水量较之高。所以，氮代谢又活跃起来，含氮量回升，氨基酸又积累。施肥也影响游离氨基酸的含量。12月初施肥可促进氨基酸含量增多，有利于春茶滋味等；而夏、暑季不施肥减少了氨基酸的合成，致使氨基酸含量减少，形成了不同季节的差异变化。

茶叶中多酚类含量占干物质量的20%～25%，对成品茶色泽、香气、滋味等品质的形成有重要影响，影响茶汤口感和色泽[21]。茶多酚含量呈春季<秋季<暑季<夏季的递增趋势。夏、暑季光照强烈，日照时间长，儿茶素合成加快，积累多于分解；高温少雨，导致茶树体内酶活性增强，有机物质的运输加快，呼吸强度大，茶树糖代谢速度快，次级代谢产物多，且空气湿度较低，水分蒸发量大，导致茶树叶片气孔关闭，CO2进入叶片难度大，光合作用受抑制，因此多酚类积累较多。春、秋两季，光照强度较夏、暑季弱，日照时间相对较短，气温较温和，雨水充沛，光合作用等活动正常进行，生理机能正常，多酚类正常合成。因此夏、暑季茶多酚含量高于春、秋季。

季节不同，其环境条件（光照、温度、水分等）和施肥情况也不同。光照强度和时长、温度和水分，影响着光合作用和茶树的碳氮代谢。光照强，时间长，氮代谢被抑制，碳代谢加快；光照弱，时间短，则相反。高温少雨则抑制氮代谢，增强碳代谢。因此，作为含氮化合物的咖啡碱及游离氨基酸春季含量最高，夏、暑季含量低；作为碳代谢产物的茶多酚则在夏季达到最高，春、秋季则降低。冬季施肥可促进春季茶树含氮量增加，提高春茶品质。本研究可为紫化茶树成品茶的加工提供一定理论依据，可适当地选择采摘特定季节下的鲜叶进行加工，满足生产和市场上的需要。

花青素因其保健功能，近年来被广大学者所关注，高花青素茶树种质也因其特异性而成为研究热点[6-7]。罗正飞等[22]得到“紫鹃”茶中花青素的最佳醇提条件为：70%乙醇溶剂、回流提取30 min、回流温度80 ℃、研究料液比1：10，但未对提取溶剂做出研究优化。本研究选取了盐酸甲醇、盐酸乙醇及盐酸丙酮来做提取优化。李智等[14]采用酸性甲醇作为提取溶剂。甲醇具有一定毒性，考虑到其在食品中的适用性，因此本研究采用酸性乙醇溶液作为提取溶剂。本研究优化的花青素提取方法能有效提取茶叶花青素，可为后续研究提供一定参考。

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