潘红 赖呈纯 黄贤贵 范丽华 段长青 李绍振

摘  要  以刺葡萄2個同质不同型的愈伤组织细胞系为材料，研究不同处理因子对其花青素和原花青素合成能力的影响。试验结果表明，刺葡萄DLR细胞系具有高产花青素和原花青素的能力，在培养至45 d时，其花青素与原花青素的含量均达到最高值，分别为113.85 μg/g（FW）和 3 562.95 μg/g（FW）;低温、高温、肉桂酸、壳聚糖、紫外线、黑暗和KT等因子，对DLR细胞系花青素和原花青素的累积表现出不同的效应;其中，4 ℃低温处理下，DLR细胞花青素的积累效果最佳，比对照提高了2.14倍;壳聚糖处理下，原花青素积累效果最佳，是对照的2.84倍。刺葡萄DLW细胞系不具有或极低的花青素和原花青素合成能力，处理因子调控对其作用效果不明显。本研究的结论为进一步进行刺葡萄细胞花青素和原花青素合成调控奠定了基础。

关键词  刺葡萄;愈伤组织;花青素;原花青素;合成调控中图分类号  S663.1;TS255.1     文献标识码  A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.012

花青素是一类具有多个酚羟基的黄酮类化合物，广泛存在于植物的叶、花、果实、种子、根块中，可呈现橙色、红色至蓝色的水溶性天然色素^[1]。原花青素是植物中广泛存在的多酚类化合物，在酸性介质中加热可形成花青素^[2]。研究表明，花青素和原花青素是天然的抗氧化剂，具有清除人体自由基、保护心血管、促进细胞增殖、抗肿瘤、抗突变、抗炎、促进视力等生物学活性，在人类健康保护方面发挥着越来越重要的作用^[3-6]。目前市场上的花青素和原花青素主要是从植物中获取，天然花青素和原花青素的合成不仅与遗传基因相关，还与外界环境因子相关，生产受到很大的限制^[7-8]。葡萄中花青素和原花青素的含量较其他植物中高^[2]，但大量提取应用势必对生产带来极大的压力。随着技术的不断革新，植物细胞培养被认为是获得植物次生代谢产物的有效途径^[9]。利用植物细胞培养技术可以在可控的条件下，有目的地提高花青素和原花青素的含量，进而进行大规模工厂化生产。在植物细胞培养的过程中，前体饲喂和诱导子一般具有高度的专一性，添加合适的代谢前体和诱导子可以提高细胞中次生代谢产物产量。有研究表明，代谢前体、诱导子和激素等对花青素和原花青素含量的积累存在差异^[10-11]。目前，未见刺葡萄愈伤组织花青素和原花青素生物合成调控的相关报道。为了探索前体饲喂和诱导子对刺葡萄细胞花青素和原花青素诱导的效果，本课题组在诱导并长期保存的刺葡萄细胞系的基础上，研究了培养时间、前体饲喂和不同诱导子等处理下刺葡萄细胞中花青素和原花青素含量变化情况，以期为定向调控刺葡萄细胞花青素和原花青素合成提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  材料

以福建省农业科学院农业工程技术研究所葡萄研究中心长期继代保存的2个同质不同型的刺葡萄愈伤组织细胞系DLR和DLW^[12]为实验材料。DLR细胞系稳定呈紫红色，DLW细胞系稳定呈浅黄绿色。

1.2  方法

1.2.1  不同阶段的刺葡萄愈伤组织培养  将刺葡萄愈伤组织DLR、DLW接入附加1.0 mg/L 2，4-D的MS固体培养基中，培养10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d时分别取样。培养室温度为25 ℃，光照强度1 500～2 000 lx，相对湿度50%～60%，每天光照12 h。设5次生物学重复。

1.2.2  不同处理下的刺葡萄愈伤组织培养  温度处理：刺葡萄愈伤组织培养至24 d时，将其分别置入4 ℃、37 ℃的温度条件下，培养24 h后取样，并以培养室（25 ℃）培养的愈伤组织为对照。肉桂酸处理：将培养至24 d时的DLR、DLW愈伤组织置于浓度为40 mg/L的肉桂酸溶液中（肉桂酸溶液采用附加1.0 mg/L 2，4-D的MS液体培养基配制），在培养室中培养24 h后取样。壳聚糖处理：将培养至24 d时的刺葡萄愈伤组织置于浓度为800 mg/L的壳聚糖溶液中，在培养室中培养24 h后取样。暗培养处理：将刺葡萄愈伤组织于遮光条件下培养25 d后取样。UV-B处理：将培养至24 d时的DLR、DLW愈伤组织置于紫外灯（0.15 W/m²）下照射3 h，再培养24 h后取样。KT处理：将DLR、DLW愈伤组织接种到附加1.0 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的MS培养基中培养25 d。以上各处理除了暗培养外均在光照条件下培养，均以附加1.0 mg/L 2，4-D的MS固体培养基中培养25 d的愈伤组织为对照，培养室温度为25 ℃，光照强度1 500～2 000 lx，相对湿度50%～60%，每天光照12 h。实验均设5次生物学重复。刺葡萄愈伤组织收集过程去除培养基，用滤纸吸附多余水分，装入塑封袋，液氮速冻后，放入–80 ℃保存备用。

1.2.3  花青素与原花青素含量测定  参照赖呈纯等^[12]报道的方法进行刺葡萄愈伤组织花青素与原花青素含量的提取与测定。

1.3  数据分析

采用Excel软件处理数据，并利用DPS软件进行数据统计和方差分析。

2  结果与分析

2.1  不同培养阶段的刺葡萄细胞培养物花青素含量

2个刺葡萄细胞系DLR和DLW（图1）在不同培养阶段中花青素含量的变化如图2所示。从图2可以看出，DLW刺葡萄细胞中几乎检测不到花青素的存在，整个培养过程都维持在痕量的水平，含量在0.05～0.50 μg/g（FW）变化，这说明DLW细胞系几乎不合成花青素或没有合成花青素的能力。随培养时间的延长，DLR刺葡萄细胞中花青素含量呈一个动态的变化，类似M形变化趋势，即先缓慢增加，20 d后快速增加，30 d后急剧增加，35 d形成一个高峰后开始快速下降，40 d降到低点，随后又快速增加，45 d达另一个高峰，而后又迅速下降，一直持续到60 d，花青素含量在7.39～113.85 μg/g（FW）变化。35 d和45 d是DLR细胞系花青素含量累积的2个高峰，含量分别为109.04 μg/g（FW）和113.85 μg/g（FW），与其他阶段的DLR细胞培养物花青素含量相比，差异极显著（p<0.01）;含量最低值出现在培养的第10 天，仅为7.39 μg/g（FW）。这种双峰的变化，可能与DLR细胞系花青素的累积不同的大写字母表示差异极显著（p<0.01），不同的小写字母表示差异显著（p<0.05）;DLW由于数值太小，不进行差异显著性分析。

与细胞的衰老存在相关性，当前期细胞生长到35 d时，花青素的累积达到高峰，35 d后随着细胞衰老，花青素合成受阻，部分降解，40 d后抗衰老的机制运行，花青素合成再次激活，45 d花青素含量又形成一个高峰，之后随着细胞的进一步衰老，花青素合成再次受阻，并且快速降解。

2.2  不同处理下刺葡萄细胞培养物花青素含量

在不同处理条件下，刺葡萄DLR、DLW细胞系花青素含量变化情况如图3所示。DLW细胞系其花青素的含量并没有明显增加，仍维持在极低水平，在0.35～0.65 μg/g（FW）变化，这说明不同因子处理对DLW细胞系花青素合成的诱导是无效的。对于DLR细胞系来说，不同因子的处理对其细胞培养物花青素含量的累积有很大影响，其中，4 ℃低温处理对花青素累积的促进效果最好，其花青素含量为46.05 μg/g（FW），比对照的21.47 μg/g（FW）提高了约2.14倍;壳聚糖处理后，花青素含量为39.31 μg/g（FW），比对照提高了约1.83倍;高温37 ℃处理也能较大幅度提高细胞中花青素含量，为35.16 μg/g（FW），比对照增加了1.64倍;UV处理花青素含量为26.44 μg/g（FW），比对照增加了1.23倍;肉桂酸处理下，细胞花青素含量不升反降，可能是加入肉桂酸代谢前体会改变花青素合成途径中次生产物的累积水平;0.5 mg/L KT处理对DLR细胞花青素

2.3  不同培养阶段的刺葡萄细胞培养物原花青素含量变化

不同的培养时间对原花青素含量的积累具有较大的影响。从图4可以看出，刺葡萄DLW细胞系原花青素含量在整个培养过程中都维持在一个很低的水平，检测到的原花青素含量在52.56～ 130.48 μg/g（FW）。DLR细胞系持续的培养过程中，原花青素含量变化呈現为倒V形，检测到的原花青素含量在577.33～3 562.95 μg/g（FW）： 10～15 d略微下降，之后持续快速上升， 35～40 d时有一个停滞阶段，40～45 d又开始迅速增加，45 d原花青素含量达到最大累积量，为3 562.95 μg/g（FW），而后又断崖式地迅速降低，直至60 d。这种变化趋势可能是与DLR细胞的生长和衰老相适应的结果，35 d后细胞开始衰老，衰老的反应机制到40 d后开始建立，45 d后细胞大部分进入衰老，合成受阻并且次生产物开始降解，导致其原花青素的含量持续下降。

2.4  不同处理下刺葡萄细胞培养物原花青素含量变化

经过不同因子处理，刺葡萄DLR、DLW细胞系原花青素含量变化如图5所示。对于DLW细胞系，不同因子的处理并不能增加其原花青素含量，说明这些处理对于其原花青素的合成是无效的。对于DLR细胞系来说，各因子的诱导效果差异较大，处理后对刺葡萄DLR细胞培养物原花青素的累积效果为：壳聚糖>KT>37 ℃>肉桂酸> 4 ℃>UVB>CK>暗培养。浓度为800 mg/L的壳聚糖对DLR细胞培养物原花青素累积效果最好，含量可达到3 742.96 μg/g（FW），比对照[1 317.85 μg/g（FW）]增加了2.84倍;其次为KT，原花青素含量为3 311.89 μg/g（FW），比对照增加了2.51倍左右;4 ℃、37 ℃和肉桂酸处理也能显著增加原花青素含量，增加1.6倍以上。这说明壳聚糖、激素、37 ℃、肉桂酸和4 ℃处理均可以增加刺葡萄细胞原花青素的合成与累积;紫外光对刺葡萄细胞原花青素的合成有一定的抑制作用，而暗培养对其原花青素的合成有强烈的抑制作用，说明光照对原花青素的合成同样是必需条件。

2.5  刺葡萄细胞花青素和原花青素合成的关联性分析

植物花青素和原花青素的合成经由了次生代谢苯丙烷类途径和类黄酮途径，从形成无色花青素后出现分支^[13-14]。就刺葡萄DLW细胞系而言，其不能形成花青素，也几乎不合成原花青素。对于刺葡萄DLR细胞系，在连续的2个月培养过程中，其花青素出现2个累积高峰，而原花青素只有1个累积高峰，含量最高峰都出现在培养的第45天。在各种因子处理的情况下，DLR细胞代谢前体肉桂酸会抑制花青素的合成，但却显著地促进原花青素的合成;激素KT处理对DLR细胞花青素的合成没有显著的促进作用，却可以极显著地增加其原花青素的合成;紫外光处理可以显著地促进花青素的合成，但对原花青素的累积作用效果不明显。这种变化情况说明，花青素和原花青素的合成与累积具有一定的关联性，其合成和累积的过程受诸多因素的影响，这有待进一步深入的研究。

3  讨论

本研究对2个刺葡萄细胞系花青素和原花青素含量进行了分析，刺葡萄DLW细胞系花青素与原花青素含量极少，且定向调控也无明显作用，这说明其不适合用于生产花青素和原花青素。DLR细胞系具有较强的合成花青素和原花青素的能力，在培养45 d时，花青素和原花青素的含量均达到峰值。不同的调控因子对DLR细胞系花青素和原花青素的合成具有较大影响，但作用的效果存在较大差异。

4 ℃低温处理对提高花青素的积累效果最明显，低温能够诱导花青素积累，使花青素含量提高，这一现象在苹果^[15]、红橙^[16]、菊花^[17]等植物中都得到了验证。37 ℃高温处理下DLR细胞中花青素和原花青素的含量明显增加，虽然有研究表明高温抑制了合成花青素基因的表达^[15]，使植物分解代谢加剧，导致花青素合成受抑制或分解增加^[18]，但也有研究报告显示花青素生物合成基因的mRNA积累和UFGT的酶活性在高温下不受抑制^[19]。壳聚糖处理的刺葡萄DLR细胞，表现出最强的原花青素合成能力，培养25 d的细胞培养物，其原花青素含量比对照组提高了2.84倍。壳聚糖对次生代谢产物的积累作用，在许多研究中都得以证实^[20-22]。光是影响植物的重要环境因子之一，植物通过光受体感知并传递光信号，调节植物生长和发育的各个过程^[23]。在离体培养的细胞中，光通过激活花青素代谢途径中的相关酶基因的表达，对花青素苷合成进行调控，VvmyBA1是花青素生物合成的调控基因，在避光的条件下，植物细胞内源性ABA含量降低，VvmyBA1的表达被抑制^[24]。CHS、DFR、UFGT等都属于光调节酶，以光敏色素为光受体^[25-26]。刺葡萄细胞在暗培养的条件下，其花青素和原花青素的含量与对照相比分别减少了94%和55%。这说明光对刺葡萄细胞花青素和原花青素的积累具有明显的刺激作用，DLR细胞系属于光敏感型。紫外光是类黄酮生物合成的有效促进因子^[27-28]，刺葡萄DLR细胞在紫外光处理下，花青素含量显著增加，而对原花青素合成有一定的抑制作用，这种现象的作用机制还有待进一步研究。肉桂酸是花青素、原花青素合成途径的必要物质之一^[29-30]，在肉桂酸处理DLR细胞系中，发现其花青素合成能力受抑制，而能促进原花青素的合成。激素是植物生长发育过程中的一个重要调节因子，在DLR细胞培养中发现，添加KT的培养基中培养的细胞培养物，在同一时间内比未添加KT培养的刺葡萄愈伤组织DLR颜色红，呈深红色，实验结果显示，KT对刺葡萄愈伤组织DLR花青素含量的积累并没有显著性影响，但原花青素含量的积累是对照的2.51倍。以上这些现象的作用机制，均有待进一步的深入研究。

以上分析说明，处理因子的浓度或处理时间等对植物细胞次生代谢产物的积累具有一定的影响作用。过低的浓度、过短的处理时间都可能达不到诱导效果，高浓度的诱导子与长时间的处理可能对细胞次生代谢产物的积累具有一定的拮抗作用。所以处理因子的使用量与处理时间也有一定的要求。虽然本研究未对各处理因子的使用浓度或处理时间做深入研究，但为后续研究提供了方向，为进一步开展刺葡萄细胞花青素和原花青素合成定向调控与基因表达的相关研究奠定了基础。

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