于青林，孟令莉，霍海亮，高翠娟

(临沂大学 生命科学学院，山东 临沂，276000)

琥珀酸是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物，被美国能源部认为是未来十二组最具价值的生物炼制产品之一[1]，广泛地应用于清洁剂、表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂，并用于合成γ-丁内酯、四氢呋喃等多种重要化学品[2]。同时，作为一种重要的有机合成中间体，琥珀酸还是合成多种聚酯的重要前体物质[3]，近年来逐渐攀升为大宗化学品，全球年产量在3万～5万t[4]。传统的化学法合成琥珀酸需要金属Pd和Ru的催化，通过丁烷制备顺式丁烯二酸酐再经化学方法加工而成[5]。由于石油资源的减少和环境污染问题的日益严重，资源可再生的、高效环保的琥珀酸生产方式愈来愈受到关注。琥珀酸是微生物细胞中心代谢三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA)的中间代谢产物之一，并且还是多种兼性厌氧菌和严格厌氧菌的代谢末端产物，可以通过微生物利用可再生的碳水化合物资源进行生产[6-8]。

解脂酵母(Yarrowialipolytica)属于非传统酵母，具有生物安全(generally recognized as safe, GRAS)、鲁棒性的特点[9]。经过遗传改造后的解脂酵母可以作为细胞工厂有效生产许多高附加值的化学品和脂肪/脂肪酸衍生的燃料，如柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸等[10-13]。2009年，KAMZOLOVA等人利用构建好的产α-酮戊二酸解脂酵母首先生产α-酮戊二酸，再以乙醇为底物在过氧化氢存在的情况下脱羧生产琥珀酸，琥珀酸的产量为63.4 g/L[14]。2010年，YUZBASHEV 等人首先突变解脂酵母的琥珀酸脱氢酶Sdh2亚基，然后采用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍进行化学诱变，获得的突变株Y-3314以甘油为底物、碳酸钙为缓冲剂进行低pH琥珀酸发酵，得到45 g/L的琥珀酸盐[15]。笔者实验室通过基因敲除琥珀酸脱氢酶Sdh5亚基成功获得可产琥珀酸的重组解脂酵母PGC01003，该重组酵母在琥珀酸发酵的同时还产生较多的副产物乙酸[16]。随后，在PGC01003的基础上进一步敲除乙酰辅酶A水解酶编码基因ach1，获得重组酵母PGC11505，乙酸溢出得到有效控制[17]。本研究以重组酵母PGC11505为宿主，甘油作底物，对生产琥珀酸的发酵罐转速、通气量、初始甘油质量浓度、蛋白胨质量浓度以及发酵罐的pH控制进行优化,重组酵母琥珀酸产量得到明显提高，为工业化生产打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母粉、蛋白胨，均为OXOID公司；甘油(分析纯)，天津大茂化学试剂厂；重组解脂酵母(Yarrowialipolytica)PGC11505为本研究室保藏。

1.2 仪器与设备

2.5 L发酵罐，德国贝朗医疗有限公司；0.22 μm水溶性滤膜，天津市东康科技有限公司；高压液相色谱，日本岛津公司；UV-1800分光光度计，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 种子培养与发酵

采用YPG(酵母粉10 g/L、蛋白胨 20 g/L、甘油20 g/L)培养种子，发酵培养基含酵母粉10 g/L、蛋白胨和甘油的质量浓度除特殊说明分别为20 g/L和100 g/L。所有培养基在121℃灭菌20 min。从固体平板上刮取适量菌苔至内含50 mL YPG的250 mL锥形瓶，28℃、200 r/min培养24 h，然后无菌接种至发酵罐。依次对转速、溶氧、碳源质量浓度、蛋白胨质量浓度、发酵罐的pH值进行优化。定时取样测菌体浓度、发酵上清液的甘油与有机酸质量浓度。补料分批发酵的初始甘油质量浓度为100 g/L，不控制发酵罐的pH值、28 ℃、600 r/min、1 vvm，当甘油质量浓度低于20 g/L时补加80 mL质量浓度为750 g/L的甘油母液。

1.3.2 分析方法

采用分光光度计测定600 nm的菌体吸光值，然后依据菌体OD值与菌体干重(DCW)之间的线性关系进行换算。甘油、琥珀酸、乙酸质量浓度采用高压液相色谱进行测定。具体操作为，1 mL发酵液离心后取上清液，用0.22 μm水溶性滤膜过滤，加至高压液相色谱专用的小瓶内，放置在自动进样器中。色谱柱为美国伯乐Aminex HPX-87H 糖分析柱，检测器为示差折光检测器，流动相为5 mmol/L稀H2SO4，流速为0.6 mL/min，柱温箱的温度设定在65 ℃。利用发酵罐的在线自动pH值监测系统记录发酵液的pH值。

2 结果与分析

2.1 溶氧对琥珀酸产量的影响

解脂酵母是严格好氧菌，氧气对菌体生长和产物合成都非常重要。影响溶氧的主要因素是发酵罐内置挡板的转速和通气量。首先实验了不同转速和通气量对琥珀酸产量的影响(图1)。经过72 h发酵，转速400和600 r/min的菌体生物量为6.2和14.2 g/L(以DCW计)，分别产生了1.3和1.5 g/L乙酸，证实重组解脂酵母PGC11505的乙酸溢出得到有效控制。转速为600 r/min时，重组菌PGC11505可消耗52.0 g/L甘油产生17.0 g/L琥珀酸，而转速为400 r/min时只消耗了21.9 g/L甘油产生8.3 g/L琥珀酸。较高的转速可以提供更充分的溶氧，利于菌体生长和琥珀酸的生产。

图1 发酵罐不同转速对琥珀酸发酵的影响
Fig.1 Influence of speed of revolution on succinic production of Y. lipolytica

通气量分别为0.5、1.0、2.0 vvm时对琥珀酸发酵的影响见图2。通气量对重组菌PGC11505的甘油消耗、菌体生长及琥珀酸发酵影响较小。重组解脂酵母PGC11505在发酵72 h后，菌体生物量依次为17.7、21.9、21.0 g/L，分别产生了18.6、20.1、19.7 g/L琥珀酸。从节能和琥珀酸的产量综合考量，确定1.0 vvm为最适通气量。

a-不同发酵时间的甘油浓度；b-不同发酵时间的菌体干重；c-不同发酵时间的琥珀酸产物浓度
图2 不同通气量对琥珀酸发酵的影响
Fig.2 Influence of various aeration rates on succinic production of Y. lipolytica

2.2 初始甘油浓度对琥珀酸产量的影响

解脂酵母具有较高的渗透压耐受性，然而初始碳源浓度过高可能会产生底物抑制，菌体分泌甘露醇、赤藓糖醇等多元醇以对抗高渗透压。本组实验比较了初始甘油质量浓度为50、100、150 g/L对琥珀酸发酵的影响。图3显示不同初始甘油质量浓度对琥珀酸发酵的影响较大。甘油质量浓度为50 g/L时，菌体在40 h消耗全部甘油，产生14.2 g/L琥珀酸。随着甘油质量浓度的增加，发酵周期延长，菌体生物量和琥珀酸产量也相应的提高。甘油初始质量浓度为100 g/L时，22.6 g/L菌体发酵72 h产生20.1 g/L琥珀酸。当甘油质量浓度增加至150 g/L时，发酵98 h仍残余69.3 g/L的甘油，菌体生长受到抑制，生长差，最大生物量为19.0 g/L，琥珀酸产量为21.0 g/L。初始甘油质量浓度为100 g/L能保证菌体较好的生长，并且发酵较充分，获得较高的琥珀酸产量。

a-不同发酵时间的甘油浓度；b-不同发酵时间的菌体干重；c-不同发酵时间的琥珀酸产物浓度
图3 不同初始甘油质量浓度发酵产琥珀酸比较
Fig.3 Succinic acid production from various concentrations of glycerol

2.3 蛋白胨含量对琥珀酸产量的影响

作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料，微生物生长和产物合成需要充足的氮源。氮源过低菌体生长代谢差，过高则造成营养物质的浪费，因此合适的碳氮比对发酵至关重要。本实验固定甘油质量浓度为100 g/L，比较了蛋白胨的添加质量浓度为0、10、20 g/L对琥珀酸发酵的影响。由表1可见，不添加蛋白胨菌体生长差，消耗的甘油量较少，只生产9.9 g/L琥珀酸。蛋白胨质量浓度为10 g/L和20 g/L菌体生长良好，菌体量分别为18.6 g/L和17.9 g/L，分别产生20.3 g/L和20.7 g/L琥珀酸。另外，蛋白胨含量较高时的乙酸产量也升高。因此，选择10 g/L蛋白胨作为后续实验的适宜质量浓度。

表1 添加不同蛋白胨对琥珀酸发酵的影响Table 1 Succinic acid production in medium containingvaried concentraitons of peptone

2.4 发酵液pH对琥珀酸产量的影响

为减少弱酸环境对有机酸发酵的影响，通常采用控制发酵液pH值接近中性的策略进行琥珀酸发酵[15]。然而近中性环境的发酵产物是琥珀酸盐而非琥珀酸，并且发酵过程需要持续流加碱液以调节pH值，增大了发酵过程染菌的概率和发酵后提取的工序。鉴于解脂酵母的鲁棒性，我们比较分析了不同pH值条件下PGC11505的琥珀酸发酵，发酵罐的pH值分别控制在4.0、5.0、6.0以及不控制pH的自然pH值(图4)。发酵罐pH值设定为6.0的实验组，重组菌PGC11505消耗了最多的甘油、积累最高的菌体(42.4 g/L)，产生22.1 g/L琥珀酸。发酵罐pH值较低的实验组(pH 4.0、pH 5.0)，初始pH值较低的环境不利于菌体的快速生长与琥珀酸合成代谢，菌体量和琥珀酸的质量浓度都偏低。发酵罐自然pH值发酵组，在发酵初始阶段发酵液的pH值接近中性(pH6.5)，这对菌体快速进入指数生长期有利。随着菌体生长和发酵的进行，菌体进入旺盛的合成代谢阶段，琥珀酸不断积累，生产高达26.3 g/L琥珀酸。这充分表明，重组解脂酵母可以耐受天然的弱酸性环境，适合在自然低pH值下进行琥珀酸发酵。

图4 不同pH值对琥珀酸发酵的影响
Fig.4 Succinic acid production under varied pH conditions

2.5 补料分批琥珀酸发酵

最后，根据上述实验确定的最适条件进行不控制pH值的补料分批发酵。如图5所示，发酵初始时pH值为6.5，24 h即降至4.5，48 h后持续维持在3.5左右。乙酸积累量始终低于0.5 g/L。菌体生长曲线表明，重组菌PGC11505在自然弱酸性条件下生长良好，最高菌体量为26.8 g/L DCW。经过2次补料共消耗192.5 g/L甘油，合成46. 9 g/L琥珀酸，琥珀酸对甘油的产率为0.24 g/g，生产率为0.34 g/(L·h)。琥珀酸的产量较优化之前提高了4.7倍。

图5 重组解脂酵母PGC11505自然低pH值琥珀酸发酵情形
Fig.5 Fed-batch fermentation profile of engineered Y. lipolytica PGC11505 under natural low pH

3 结论

琥珀酸是一种重要的有机合成中间体。通过2.5 L发酵罐对重组解脂酵母PGC11505的琥珀酸发酵的发酵罐转速、通气量、初始甘油质量浓度、蛋白胨质量浓度、发酵罐的pH值设置优化后，琥珀酸的产量提高4.7倍。其中，发酵罐的转速600 r/min好于400 r/min，通气量为1.0 vvm时最佳。初始甘油质量浓度设定为100 g/L能保证菌体较好的生长，并且发酵充分。蛋白胨的质量浓度为10.0 g/L较适宜。不控制pH值的自然发酵获得最高的琥珀酸产量和产率，分别为26.3 g/L和0.27 g/g。经过138 h补料-分批发酵，共消耗192.5 g/L甘油，合成46. 9 g/L琥珀酸，产率为0.24 g/g，生产率为0.34 g/(L·h)。本研究表明，解脂酵母作为鲁棒性微生物，可以在不调节pH值的自然低pH值环境进行琥珀酸发酵，具备工业化生产琥珀酸的潜力。然而，实验中还发现，重组解脂酵母PGC11505除了合成琥珀酸之外，还通过磷酸戊糖途径产生较多的副产物赤藓糖醇。赤藓糖醇的生成造成底物甘油的浪费，影响甘油对琥珀酸的产率，这也为下一步的菌株改造提供了新的研究思路和方向。