李 琼，刘敏娟，何 丹，刘 欢，解 敏，王 挺，李 红，李海波

（1南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心，江苏苏州215002；2广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东广州510665）

0 引言

非整倍体与人类疾病关系的研究已逾50年的历史，是人类发育障碍和智力残疾最常见的遗传原因［1］。染色体数目异常被认为是最常见的自然流产病因［2-4］，给孕妇带来了沉重的心理和生理的伤害［5］，且有些常染色体和性染色体非整倍体的胎儿能够存活下来，这些患儿多伴随严重的肢体、器官畸形和语言智力障碍，给家庭和社会造成了沉重的负担。最常见的就是21三体、18三体、13三体以及性染色体异常。

自 1993年 Mansfield等［6］用定量荧光 PCR（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）进行唐氏综合征及其他染色体非整倍体检测以来，QF-PCR技术被证明为一种快速、准确、低成本、自动化程度高的检侧染色体非整倍体的方法，在国外得到广泛的应用［7-9］。该方法是通过对染色体上多态性位点的短串联重复序列（short tandem repeat，STR）进行扩增，经过高分辨率胶电泳（如毛细管电泳等）对产物进行分离。由于引物的荧光信号强度和扩增产物量成正比，产物量与模板量成正比，进而实现对初始模板的相对定量，以对染色体数目异常进行有效快速的产前诊断。

本研究采用QF-PCR方法与染色体核型分析方法对329例产前羊水标本进行检侧，考察新近国产QF-PCR试剂盒对常见染色体非整倍体病检测中灵敏性、特异性和准确性，评价其在染色体非整倍体快速产前诊断中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2016年3月至2016年12月因血清学筛查21／18染色体高风险、无创产前基因检测提示21／18／13／X／Y 染色体高风险、高龄或 B 超异常等原因在苏州市立医院生殖与遗传中心进行产前诊断的329例羊水样本。孕妇年龄范围19～43岁，其中35岁以下有189例（占57.45%），35岁及以上有140例（占42.55%）。在B超介导下进行羊水穿刺取样，羊水穿刺的孕周为16～22+6周，经孕妇知情同意后，进行G显带核型分析后单盲进行QF-PCR检测。

1.2 主要试剂 核酸提取或纯化试剂（中山大学达安基因股份有限公司）；临床试验用21、18、13三体和性染色体非整倍体检测试剂盒（广州市达瑞生物技术股份有限公司）。

1.3 主要仪器 Applied Biosystems定性 PCR仪9700型；Applied Biosystems基因分析仪3500 Dx型。

1.4 方法

1.4.1 染色体核型分析 在超声仪定位下，无菌操作行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，置于2只无菌离心管中离心沉淀羊水细胞，接种培养基进行培养。常规方法制备染色体、G显带，必要时行父母外周血染色体核型分析。用染色体分析软件进行分析，参考“人类细胞遗传学国际命名体制2016版”相关规范标准（an international system for human cytogenetic nomenclature，ISCN 2016），用染色体图像分析系统计数60个分裂相，镜下分析10个核型，并2次复查。

1.4.2 QF-PCR 检测位点 QF-PCR 检测采用 21、18、13及性染色体上的18个STR位点，其中21号染色体6个位点，18号染色体4个位点，13号染色体4个位点，性染色体4个位点，另外还包括牙釉蛋白基因（amelogenin，AMXY）和性别决定基因（homo sapiens sex determining region Y，SRY）2个基因位点。每一个检测位点引物对的上游或者下游引物用FAM（蓝色）或HEX（绿色）荧光物质标记。20个检测位点按照21、18、13三体和性染色体非整倍体检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）说明书要求分A、B、C三组进行，其中A组包括21号染色体6个STR位点（A1-A6）；B组包括 18号染色体4个STR位点（B1-B4）和13号染色体4个STR位点（B5-B8）；C组包括4个 X染色体STR 位点（C2、C3、C5、C6）和2个性别基因位点（C1、C4）。

1.4.3 QF-PCR检测步骤 主要操作包括：①DNA提取：按照中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂的说明书进行。②PCR扩增：按照21、18、13三体和性染色体非整倍体检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）说明书操作，具体扩增体系分三组，扩增体积为 25 μL，扩增反应条件为 95℃5 min；随后变性 95℃ 30 s，退火 58℃ 40 s，延伸 72℃50 s，共25个循环；最后72℃延伸10 min。③毛细管电泳：取 1 μL PCR 产物和 13.5 μL 甲酰胺、0.5 μL GeneScanTM600 LIZ®Size standard v2.0（内标）混合，95℃变性5 mim，放置冰上至少1 min，用3500 Dx型基因分析仪进行毛细管电泳。

1.4.4 QF-PCR结果判断及统计学方法 ①结果分析及判断标准：对3500 Dx型基因分析仪电泳得到的数据应用GeneMapper®软件进行分析。根据既往大样本阳性、阴性样本的统计得出：检测位点为单峰或者两个等位基因荧光峰面积比在0.8～1.4为正常样本峰型，检测位点为两个等位基因荧光峰面积比在0.45～0.65或 1.8～2.4 或者三个等位基因荧光峰面积比接近1∶1∶1（最大峰面积与最小峰面积比值范围为1～1.4）则为三体峰型。至少有两个位点结果符合一个正常峰型才能解释该反应结果为阴性（图1）；至少两个位点结果符合一个三体峰型才能解释该反应结果为阳性（图2）。②统计学分析：试验结果统计分析选用所有符合试验方案要求的受试者样本数据进行统计分析，主要采用四格表整理试验数据。QF-PCR检测结果和染色体核型分析结果对比采用Kappa一致性检验，Kappa值的P≤0.01被认为所检验的结果有统计学意义。

图1 阴性结果示意图（所有位点结果均为正常峰型，判断该样本为阴性）

图2 阳性结果示意图——以21三体为例（A组有5个位点结果为三体峰型（A1、A3为双峰，峰面积比在 1.8～2.4范围内；A2、A5、A6为三峰，峰面积比接近 1 ∶1 ∶1；A4多态性不能提供有效信息），综合判断该样本为21三体阳性）

2 结果

2.1 染色体核型分析结果 在检测的329例羊水样本中，染色体核型分析检测到 21、18、13、X、Y 染色体非整倍体87例，其中1例为21，13罗伯逊易位型的21三体。正常核型242例，具体染色体核型分析分布情况统计如表1所示。

表1 样本染色体核型分析结果分布情况统计

2.2 QF-PCR检测结果 在检测的329例羊水样本中，QF-PCR检测结果阳性样本87例，分别为21三体54例、18三体17例、13三体3例、性染色体非整倍体13例（XXX 7例，XXY 3例，XYY 3例）；阴性样本242例。QF-PCR检测与对比方法核型分析两者检测结果符合率为100%，但QF-PCR未能识别出是否为易位型的21三体。

2.3 统计学分析 试验真实性评价：灵敏性、特异性、准确性、Kappa值等指标计算见表2。分别计算灵敏性、特异性、准确性。 灵敏性＝87／（87+0）×100%＝100%，特异性＝242／（0+242）×100% ＝100%，准确性＝（87+242）／（87+0+0+242）×100%＝100%。

Kappa值采用 SPSS13.0软件进行统计分析，Kappa值计算结果为 1.000（P＜0.01）。 结果表明QF-PCR检测与核型分析两者检测结果无显著差异，两者检测一致性极好。

表2 2种方法检测结果的一致性评测表

3 讨论

染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切关系。其中21三体（唐氏综合征）、18三体（爱德华氏综合征）、13三体（帕陶氏综合征）和性染色体非整倍体（XXY综合征、XYY综合征等）分别是常染色体和性染色体临床最常见染色体病。此类疾病通常具有智力低下、器官多发畸形或第二性征发育异常等临床表现，且目前对染色体病尚无有效的治疗措施，此类患儿的出生将给家庭和社会带来沉重的负担［10］。因此，通过产前诊断有效阻止染色体缺陷患儿的出生尤为重要。

临床主要采用传统的染色体核型分析技术对大多数患者进行诊断，该技术虽然可以观察整套染色体的数目和主要带型，但这种方法操作繁琐、耗费人力、技术要求高，出报告时间长（2～3周），易增加孕妇焦虑情绪，还可能会错过后续最佳医学处理时机［11］。随着分子诊断的发展，QF-PCR技术在产前诊断中的应用越来越广泛［11-15］，此技术可以在数小时内检测常见的染色体数目异常，具有快速、准确、低成本、高敏感性和高特异性的优点，并且能够自动化操作。

本研究中329例产前诊断样本，QF-PCR和对比方法（金标准染色体核型分析法）均检测出阴性样本242例，阳性样本87例，包括21三体54例、18三体17例、13三体3例、性染色体非整倍体13例（XXX 7例，XXY 3例，XYY 3例）。其中1例核型分析结果是21，13罗伯逊易位型的21三体，QF-PCR检测结果为21三体，说明QF-PCR可以对罗伯逊易位型的21三体进行准确检测，但不能明确其为易位型，鉴于易位型21三体同常规21三体造成的临床结局一致，是检测目标不同不属于漏检。本研究结果表明QFPCR技术在检测这五种非整倍体上灵敏性、特异性和准确性均为 100%，Kappa 值为 1.000（P＜0.01），两者检测结果无显著差异，一致性好。

STR位点的合理选择和体系设计可使QF-PCR检测染色体非整倍体异常检测结果更准确可信［16］。本研究中QF-PCR检测采用的是广州市达瑞生物技术股份有限公司研制开发的21、18、13三体和性染色体非整倍体检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法），该试剂盒采用21、18、13及性染色体合计18个STR位点，其中21号染色体6个位点，18号染色体4个位点，13号染色体4个位点，性染色体4个位点，另外还包括牙釉蛋白基因（AMXY）和性别决定基因（SRY）2个基因位点。该试剂盒分三个体系同时进行检测，分别为A组（21号染色体）、B组（18和13号染色体，18和13号染色体上的位点颜色不同）和C组（性染色体），同一条染色体的位点集中在一个检测体系中，使检测易于实现实验操作和结果判读的标准化和规范化，降低人工操作和判断的出错率。在329例QF-PCR检测结果中，未出现单条染色体全部STR位点纯合以致结果无法判读的情况，核型分析检测到的所有正常核型用QF-PCR检测均无染色体数目异常，21、18、13、X及 Y五种染色体非整倍体用QF-PCR技术均可全部检出，无假阳性。说明该试剂盒针对选择的位点及相应数目合理，体系设计稳定可行，具有较高的临床应用价值。

以QF-PCR技术开发的国产化快速检测试剂盒具有较好的灵敏性和特异性，可作为染色体核型分析的重要补充，优化完善产前诊断体系，不论是减轻长时间等待诊断结果给孕妇及其家属带来的心理压力，还是帮助产科医生及时做出处理措施方面都有重要的临床应用价值。因此，如果能将这一技术更好地与我国医疗实际相结合，必将更好地服务于临床。

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