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(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室,广东湛江 524091)

粉葛(PuerariaethomsoniiRadix)又名甘葛、野扁葛等,为多年生豆科(Leguminosae)落叶藤本植物的干燥根,通常在秋、冬两季采挖,其淀粉含量高达40%,并富含纤维素、蛋白质、氨基酸、脂肪、黄酮类物质及13种人体所必需的微量元素,具有较高的营养价值和药用价值[1],是一种药食同源的天然植物资源,素有“南葛北参”和“南方人参”之称[2],不仅对冠心病、心绞痛、肠癌等具有明显疗效,还可促进人脑的血液循环、增强记忆、降低血脂、减肥健美等功效[3]。

在贮藏和加工过程中,新鲜粉葛切割后表面很容易发生酶促褐变,严重影响产品感官品质和内在质量,缩短货架期。护色是粉葛鲜切后直接作为果蔬产品或其他加工的必要步骤,鲜切产品表面褐变主要是以多酚氧化酶(PPO)为主的系列酶,催化特殊的酚类底物氧化成醌类褐色化合物[4],同时也与因刺激产生的乙烯及呼吸速率的升高[5]、酚类物质成分的变化以及抗氧化水平的高低[6]等一系列生理生化变化密切相系。目前葛根鲜切后护色方法包括热烫和预煮,亚硫酸钠喷涂[7],含有氯化钙、柠檬酸、抗坏血酸等复合护色剂浸泡等[8],但热烫和预煮的方法会使葛根中的功能活性物质受到破坏,且淀粉易糊化,影响产品品质和风味,而硫化物处理后不但降低产品营养品质,其残留还可引起某些人的过敏反应。氯化钙作为采后处理保鲜剂,在延缓褐化、提高果实硬度、推迟果实后熟等方面有广泛报道[9]。

卤化盐(NaCl、KCl、CaCl2、NaF、NaBr、NaI等)可抑制鲜切果蔬的褐化,以氯化钠最为典型,作为一种价格低廉、无毒无味的食品添加剂可有效延缓鲜切苹果、鲜切梨片褐化,但在鲜切粉葛上尚未报道。本实验就0.1 mol/L氯化钠处理延缓鲜切粉葛褐化的机理进行探讨,对鲜切粉葛护色工艺配方筛选提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

粉葛湛江寸金农贸市场;托盘山东恒信基塑业股份有限公司;0.05 mm厚度聚乙烯保鲜膜国家农产品保鲜工程中心;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、邻苯二酚、愈创木酚等试剂均为分析纯;实验用水屈臣氏蒸馏水。

UV-1700型紫外-可见分光光度计日本岛津公司;台式冷冻离心机Thermo-scientific公司;HH-S4型电热恒温水浴锅北京恒瑞鑫达科技有限公司;ME303电子天平瑞士梅特勒托利多公司;恒温恒湿箱上海一恒科技有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1样品处理及贮藏挑选新鲜、大小均匀、无损伤、无病害的粉葛,清洗后用灭菌的工具去皮、切成1 cm×1 cm×1 cm的小块,用1.0%的二氧化氯进行二次清洗,之后分别放在蒸馏水(CK组)、0.1 mol/L NaCl[7]溶液中浸泡10 min,沥干之后装入塑料托盘中,每个托盘约装100 g粉葛,然后用聚乙烯保鲜膜封口包装,置于5 ℃恒温恒湿箱中贮藏,每隔2 d取样一次测定各项指标,每次测定各取每组样品一托盘。

1.2.2指标测定

1.2.2.1褐变度测定参考谭谊谈等[10]方法,称取新鲜样品1 g,切碎研磨后加入10 mL预冷蒸馏水,在25 ℃,6000×g离心20 min,取上清液待测,以蒸馏水为对照,测定波长410 nm处的吸光度,褐变度用10×A410 nm表示。

1.2.2.2苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照曹健康[11]的方法,称取1 g样品组织研磨,加入5 mL预冷的pH8.8硼酸缓冲液(含5 mmol/Lβ-巯基乙醇+1%聚乙烯吡咯烷酮),12000×g，4 ℃离心15 min,取上清待测。每个离心管中加入3.4 mL pH8.8硼酸缓冲液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液、0.1 mL酶提取液,摇匀,37 ℃保温30 min,后立即加入0.1 mL 6 mol/L盐酸终止反应,测定A290 nm。以每小时每克鲜样品反应体系吸光度增加0.01为一个PAL活性单位(U),单位为U/(h·g)。

1.2.2.3总酚含量测定参考王艳颖等[12]方法并作修改,以咖啡酸为标准品制得回归方程为y=2.9664x+0.0002(R2=0.9928),以甲醇溶液作空白参比调零,取上述滤液于280 nm波长处测定其吸光度,酚类含量以(mg咖啡酸/g)表示。

1.2.2.4多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)及过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性测定均参照谭谊谈等[13]的方法。称取1 g样品于研钵中,立即加入6 mL预冷pH6.8的0.1 mol/L 磷酸缓冲液(含1%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨,12000×g、4 ℃下离心15 min,上清液为粗酶液,测定室温条件下420 nm波长处,反应液1 min内吸光度的变化。以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位(U)。POD活性测定时则加入2.7 mL pH6.8的0.1 mol/L的磷酸缓冲液、0.1 mL 4%的愈创木酚、0.1 mL 0.5%H2O2和0.1 mL酶提取液,于室温条件下测定反应液在1 min内波长470 nm处吸光度的变化,以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位(U)。

1.2.2.5丙二醛(malondialdehyde MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法进行测定[14]。

1.2.2.6总黄酮含量测定参考张棋等[15]方法,以葛根素为标准品得回归方程为y=11.647x+0.0072(R2=0.9977),称取2 g新鲜样品,加入10 mL预冷甲醇室温避光静置12 h,12000×g离心10 min,取上清液待测。每管加入4.3 mL蒸馏水,0.5 mL上述提取液,0.1 mL 10%氯化铝,0.1 mL 1 mol/L乙酸钾,室温30 min后测定波长415 nm处的吸光度。根据葛根素标准曲线计算总黄酮提取量,结果以葛根素当量表示(mg葛根素/g)。

1.3　数据分析

2　结果与分析

2.1　氯化钠处理对鲜切粉葛褐变度的影响

褐变度是酚类物质被氧化成褐色聚合物的程度的表现[16]。从图1可以看出,粉葛鲜切后在贮藏过程中褐变度不断上升,颜色由白色逐渐变成深黄色,最后变成褐色乃至黑色。0.1 mol/L氯化钠处理延缓了鲜切粉葛的褐变进程,贮藏2 d时,氯化钠处理粉葛的褐变度(1.87)比对照粉葛(2.10)低10.9%,差异显著(p<0.05)。贮藏10 d时,氯化钠处理粉葛的褐变度(3.01)仅为对照粉葛(4.36)的69%,差异达到极显著水平(p<0.01),表明0.1 mol/L氯化钠处理可有效延缓鲜切粉葛褐化。

图1　0.1 mol/L NaCl处理对鲜切粉葛褐变度的影响Fig.1　Effect of 0.1 mol/L NaCl treatment on browning of fresh-cut Pueraria

2.2　氯化钠处理对PAL和总酚含量的影响

PAL是与酚类物质生物合成直接相关的酶,能够将苯丙氨酸分解成酚类和类黄酮等,而酚类物质作为褐变底物可以被多酚氧化酶氧化形成褐色醌类物质[4]。从图2A可知,粉葛鲜切后刺激PAL活性不断升高,在整个贮藏过程中氯化钠处理和对照处理鲜切粉葛PAL活性呈不断上升的趋势;贮藏前4 d变化缓慢,二者之间无显著性差异;贮藏6 d时,对照处理粉葛PAL活性急剧上升;贮藏结束时,氯化钠处理粉葛的PAL活性则显著低于对照,仅为对照组的77.6%。由图2B可知,在贮藏过程中鲜切粉葛总酚含量呈增加的趋势,氯化钠处理显著降低了贮藏过程中的总酚含量(p<0.05)。机械损伤大量呼吸引起代谢、糖代谢、能量代谢和苯丙烷类代谢途径,提高呼吸代谢和能量代谢水平,为酚类物质合成提供物质和能量保障,在贮藏期前6 d,氯化钠处理可能并非通过影响PAL活性来减少酚类物质合成;在贮藏期后4 d,氯化钠处理降低了PAL活性同时减少了酚类物质的合成。

图2　0.1 mol/LNaCl处理对鲜切粉葛PAL活性(A)和总酚含量(B)的影响Fig.2　Effect of 0.1 mol/L NaCl treatment on the activity of PAL(A)and content of total phenol(B)of fresh-cut Pueraria

2.3　氯化钠处理对PPO和POD活性的影响

PPO和POD是果蔬中酶促褐变过程中两个重要的酶,PPO催化酚类物质氧化形成褐色物质,POD在H2O2存在下能催化酚类、类黄酮的氧化和聚合,导致组织褐变[17]。由图3A可知,PPO活性在贮藏过程中呈现先升后降再升的趋势,对照组在2 d后PPO活性开始上升,至4 d时出现小峰值为3993.50 U·g-1·min-1;而氯化钠处理组在4 d时PPO活性开始上升,至6 d时出现小峰值为4260.00 U·g-1·min-1,后缓慢下降至8 d,由此可见氯化钠处理延缓了PPO活性的上升,较对照推迟2 d出现PPO活性小高峰。图3表明,整个贮藏过程中POD活性先升高后降低,从贮藏期第2 d开始,较之对照,氯化钠处理极显著降低粉葛中POD活性(p<0.01)。说明氯化钠处理鲜切粉葛的褐变与POD活性存在较为密切的关系。

图3　0.1 mol/L NaCl对鲜切粉葛PPO(A)和POD(B)活性的影响Fig.3　Effect of 0.1 mol/L NaCl treatment on the activities of PPO(A)and POD(B)of fresh-cut Pueraria

2.4　氯化钠处理对丙二醛含量的影响

MDA是膜脂过氧化程度的指标,与组织褐变及细胞膜破坏程度及膜透性的改变有密切关系[18],图4显示,在鲜切粉葛整个贮藏过程中丙二醛含量总体呈现上升的趋势,氯化钠处理显著减少了丙二醛的积累,在2、4、6、10 d时氯化钠处理组的丙二醛含量显著低于对照处理丙二醛含量(p<0.05),说明氯化钠处理可显著降低鲜切粉葛中丙二醛含量进而延缓粉葛褐变。

图4　0.1 mol/L NaCl对鲜切粉葛丙二醛含量的影响Fig.4　Effect of 0.1 mol/L NaCl treatment on the content of MDA of fresh-cut Pueraria

表1　氯化钠处理鲜切粉葛不同生理指标之间的相关性分析Table 1　Correlation between different physiological indices in fresh-cut Pueraria with NaCl

注：**表示差异极显著(p<0.01),*表示差异显著(p<0.05),无*表示差异不显著(p>0.05),n=6。

2.5　氯化钠处理对总黄酮含量的影响

由图5可知,在鲜切粉葛贮藏过程中,总黄酮含量呈现升-降-升的趋势,2 d时氯化钠处理鲜切粉葛总黄酮含量出现小峰值0.019 mg葛根素/g,显著高于对照;而对照组则在6 d时出现小峰值0.026 mg葛根素/g,显著高于氯化钠处理;在贮藏期4 d时,氯化钠处理与对照处理的总黄酮含量分别为0.012、0.016 mg葛根素/g,二者之间差异不显著;在贮藏期8 d时,氯化钠处理与对照处理的总黄酮含量分别为0.016 mg葛根素/g和0.014 mg葛根素/g,二者之间差异不显著,至贮藏期结束,氯化钠处理鲜切粉葛的总黄酮含量显著高于对照处理。

图5　0.1 mol/L氯化钠处理对鲜切粉葛总黄酮含量的影响Fig.5　Effect of 0.1 mol/L NaCl treatment on the content of total flavonoid of fresh-cut Pueraria

2.6　氯化钠处理褐变度与褐变相关指标相关性分析

对氯化钠处理鲜切粉葛褐变度与褐变相关的生理生化指标进行相关性分析和显著性检验,结果表明褐变度与总酚含量呈极显著正相关,与PAL活性呈显著正相关,与POD活性呈显著负相关,与PPO活性、MDA呈负相关,但相关性不显著(表1)。总酚含量与褐变度(极显著)、PAL活性(极显著)、MDA、PPO活性呈正相关,与POD活性呈负相关;PAL活性与褐变度(显著)、总酚含量(极显著)、MDA、PPO活性呈正相关,与POD活性呈负相关;POD活性与褐变度(显著)、总酚含量、PAL、MDA、PPO活性呈负相关;MDA与褐变度、总酚含量、PAL、PPO活性呈正相关,与POD活性呈负相关,PPO活性与褐变度、总酚、PAL、MDA呈正相关,与POD活性呈负相关。

3　讨论与结论

表面的褐变是制约鲜切粉葛品质和货架期的主要因素,大多发生在其近皮部位和中部的脉管中,氯化钠做为一种低廉、广泛应用的食品添加剂可以有效降低鲜切粉葛的褐变度。

PAL是苯丙氨酸代谢途径中的第一个酶,能够分解苯丙氨酸经过一系列反应合成酚酶氧化底物酚类和类黄酮,升高的PAL活性可加速果蔬中的组织褐变。但高慧[19]等发现EBR处理鲜切莲藕可降低PAL活性来减轻莲藕褐变,同时Zhang[20]和Sun[21]发现用CO和H2O2处理鲜切藕片PAL活性的升高也可减轻莲藕褐变。本实验表明,鲜切粉葛褐变发生与PAL活性、酚类物质的含量呈极显著正相关,氯化钠可显著降低整个贮藏过程中的总酚含量进而延缓粉葛褐变。PPO与POD是酶促褐变过程重要的两个酶,在贮藏2～4 d内,氯化钠处理显著降低了PPO活性,使鲜切粉葛PPO活性高峰推迟2 d出现,同时0.1 mol/L氯化钠可通过降低POD活性进而延缓鲜切粉葛的褐化。0.1 mol/L氯化钠可降低鲜切粉葛贮藏过程中丙二醛含量,但鲜切粉葛褐变度与丙二醛含量呈不显著正相关。总黄酮是粉葛的主要活性成分,0.1 mol/L氯化钠处理可促进鲜切粉葛总黄酮初期积累,在贮藏期结束时维持鲜切粉葛较好的营养品质。

刘忆东等[22]发现,PPO活性、总酚物质含量和细胞膜透性是影响中华寿桃褐变的直接因素,邹丽红等[23]发现影响砂梨果肉褐变的主要因素是总酚含量及PPO活性,本实验发现总酚含量、PAL活性、POD活性与鲜切粉葛褐变呈显著相关,0.1 mol/L氯化钠可通过降低总酚含量以及抑制POD活性来对鲜切粉葛起到一定的护色作用,作为一种无毒无害且成本低廉的抗褐变剂可得到推广使用。

[1]叶金桥.超级粉葛的特性及栽培技术要点[J].基层农技推广,2013,1(6):74-75.

[2]李臻,赖富饶,吴晖.葛根的营养成分分析[J].现代食品科技,2011,27(8):1010-1011.

[3]张钟,陈媛,张玲,等.高州粉葛淀粉提取及性质测定[J]. 食品工业科技,2014,35(17):193.

[4]张鲁斌,宋康华,谷会,等.柠檬酸处理对鲜切粉葛褐化保鲜效果研究[J].热带作物学报,2017,38(6):1-7.

[5]Saltveit ME.Effect of ethylene on quality of fresh fruits and vegetables[J].Postharvest Biol Technol,1999,15:279-292.

[6]Fernando Reyes L,Emilio Villarreal J,Cisneros-Zevallos L.The increase in antioxidant capacity after wounding depends on

the type of fruit or vegetable tissue[J].Food Chem,2007,101:1254-1262.

[7]刘胜男,杜先锋.葛根加工过程中酶促褐变及其护色效果研究[J].农产品加工学刊,2011,2(2):40-43.

[8]戴卿,侯温甫,王宏勋,等.葛根中多酚氧化酶性质及葛根护色的研究[J].食品科学,2009,30(20):430-435.

[9]Yongxin Li,Ron B H Wills,John B Golding,et al.Effect of halide salts on development of surface browning on fresh-cut’Granny Smith’(Malus domestica Borkh)apple slices during storage at low temperature[J].Sci Food Agric,2015,95:945-952.

[10]谭谊谈,曾凯芳.抗坏血酸、半胱氨酸与氯化钙复合处理对鲜切芋艿褐变的影响[J].食品科学,2014,35(4):232-233.

[11]曹建康,姜微波,赵淑梅.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京:中国轻工业出版社,2007:105-107.

[12]王艳颖,胡文忠,刘程惠.间歇升温对采后香蕉李贮藏中酶促褐变的影响[J].食品科学,2010,31(2):245-249.

[13]谭谊谈,曾凯芳.1-MCP处理对鲜切芋艿褐变的影响[J].食品科学,2014,35(2):305.

[14]Hong K Q,He Q G,xu H B,et al.Effects of 1-MCP on oxidative parameters and quality in‘Pearl’guava(PsidiumguajavaL)fruit[J].Jourllal of Honicultural Science and Biotechnology,2015,88(2):117-122.

[15]张棋,易军鹏,李欣,等.蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮及抗氧化性的影响[J].食品科学,2016,37(9):40-44.

[16]程双,胡文忠,马跃,等.鲜切果蔬酶促褐变机理及控制研究进展[J].食品与机械,2009,25(4):173-176.

[17]吕蔷,朱继英,王相友.双孢蘑菇POD酶学特性及其与褐变的关系[J].园艺学报,2016,43(3):595-602.

[18]张佳俊,曹洪波,贾浩,等.桃新品系‘保佳俊’果肉抗褐化生理机制研究[J].食品科学,2015,36(18):247-251.

[19]Hui Gao,Kongkang Chai,Ni Cheng,et al.Effect of 2,4-epibrassinolide on enzymatic browning and antioxidant activity of fresh-cut lotus root slices[J].Food Chem,2017(217):45-51.

[20]Zhang S Y,Yu Y W,Xiao C L,et al.Effect of carbon monoxide on browning of fresh-cut lotus root slice in relation to phenolic metabolism[J].LWT-Food Science and Technology,2013,53:555-559.

[21]Sun Y,Zhang W,Zeng T,et al.Hydrogen sulfide inbihits enzymatic browning of fresh-cut lotus root slices by regulating phenolic metabolism[J].Food Chem,2015,177,376-381.

[22]刘忆东.不同贮藏条件对中华寿桃的采后生理及贮藏效果的影响[D].石河子:石河子大学,2006:50-52.

[23]邹丽红,张玉垦.砂梨果肉褐变与酚类物质及相关酶活性的相关分析[J].果树学报,2012,29(6):1022-1026.