胡怡琦，楼佳栋，潘文洁，金歆怡，卢建良，钱国英*，王伟*

（1浙江万里学院生物与环境学院，浙江省重中之重学科实验室，宁波 315100；2浙江理工大学生命科学学院，杭州310018）

中华鳖（Pelodiscus sinensis）是爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属的代表动物之一，具有季节性生殖周期[1]。中华鳖是具有冬眠习性的爬行动物，精子的发生也具有明显的季节性。研究表明雄性和雌性的生殖周期并不同步，在一年的不同时期分别产生雌雄配子[2]。前期的研究表明雄性精子发生始于4、5月份，在8、9月份时正处于高峰期，直至11月末停止，然后精子一次性释放到附睾中储存起来[3]。但是冬眠期是否就是精子发生的静止期，冬眠期是否存在着精子释放尚不清楚。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是胍基磷酸转移酶家族的一员，在ATP能量快速转移方面发挥着重要的作用[4-7]。CK主要定位于ATP快速再生的细胞中，主要参与离子泵转运、磷酸肌酸穿梭、肌肉收缩、ATP再生、吞噬细胞吞噬、糖酵解调控以及神经递质的释放[8-10]。精子中能量的利用和生成是密切偶联的，CK可催化肌酸（creatine）和腺苷三磷酸（ATP）生成磷酸肌酸（CP）和腺苷二磷酸（ADP）的可逆反应，为细胞提供及时的能量储存，是精子能量合成及运输的关键酶[11]。但是，CK与中华鳖精子发生的关系鲜有报道。研究冬眠前后CK在中华鳖睾丸曲细精管中的表达定位，对于研究中华鳖精子发生的能量供应具有积极的意义。

本研究以9月、12月和来年3月的性成熟中华鳖为研究对象，对曲细精管生精上皮的组织形态学进行分析，探讨精子发生和释放的规律。同时，采用免疫组织化学方法分析CK在冬眠前后的组织表达规律，探讨CK在精子发生中的作用。

材料与方法

1 实验动物处理及样品采集

性成熟雄性中华鳖购自浙江余姚某水产养殖场。分别于当年9月、12月和第二年3月进行取样，每个时间点各取3只。其中12月份和3月份为冬眠期样品，在室外水族箱中完成自然冬眠。中华鳖屠宰后取睾丸组织，切成约5mm见方的小块，在4%多聚甲醛中固定24h后用于组织学分析。

2 石蜡切片制作及HE染色

将固定后的睾丸组织经过梯度乙醇脱水处理，在透明和浸蜡后进行石蜡组织包埋。修块后进行7 μm组织切片（RM 2125，徕卡，德国），并于40°C水浴中进行摊片和展片；随后用APES处理后的载玻片进行捞片，并在烤片机上烘干12h（40°C）。进行常规HE染色（无毒环保苏木素-伊红（H-E）染液D006，南京建成生物，中国），最后用中性树胶封片进行观察。

3 CK的免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡、止水后，经过3% H2O2甲醇-PBS溶液消除内源性过氧化物酶活性，用0.01mol/L枸橼酸缓冲液（pH6.0）进行抗原热修复后用5% BSA进行封闭，随后滴加生物素化山羊抗兔IgG一抗，具体 为 CK-B（ab151579，Abcam，USA，1:200），CK-M（ab151465，Abcam，USA，1:200），CK-S（ab189314，Abcam, USA，1:250）。孵育后进行SABC反应（SA1022，博士德，中国），DAB显色后用显微成像系统进行观察。

结 果

1 冬眠前后精子发生的显微结构特点

通过比较冬眠前后精子发生的情况，我们发现9月份睾丸曲细精管上皮细胞包含大量的初级精母细胞和精子细胞，大量发育中的精子在管腔中呈“穗状”排列（图1A-1C）。12月份睾丸曲细精管中，几乎不见初级精母细胞，但是管腔中还存在大量的精子，以及正在发生变形的精子（图1D）。在3月份的睾丸曲细精管中，管腔中存在少量的精子，几乎不见初级精母细胞和变形中的精子（图1E）；但是在曲细精管之间交界的基质处，精原细胞和初级精母细胞数量已开始增多（图1F）。

图1 中华鳖冬眠后的精子发生。A-C，9月份睾丸曲细精管，大量发育中的精子呈“穗状”排列；D，12月份睾丸曲细精管，管腔中存在大量的精子，及正在变形的精子（红色圆圈中标示）；E和F，3月份的睾丸曲细精管，管腔中存在少量的精子，图F可见靠近基质部分的精原细胞和初级精母细胞数量开始增多；L，管腔；SC，支持细胞；S，精原细胞；PS，初级精母细胞；SS，次级精母细胞；Sd，精子细胞；Sz，精子；比例尺：A, 75μm; B-F, 25μmFig.1 Spermatogenesis of Pelodiscus sinensis after hibernation. A to C, a large amount of developing sperms were arranged in spike-like pattern in seminiferous tubule of testis collected in September; D, in December samples, there were lots of sperm and some metamorphic sperms (marked by the red circle) in the lumen of seminiferous tubule; E and F, a small number of sperms existed in the lumen of seminiferous tubule collected in next March;F, the number of spermatogonia and primary spermatocytes near stroma began to increase; L, lumen; SC, sertoli cell; S, spermatogonia; PS, primary spermatocytes; SS, secondary spermatocyte; Sd, spermartid; Sz, spermatozoon; scale bar, 75μm in A and 25μm in B to F

2 冬眠前后睾丸中CKs表达特点

免疫组织化学结果显示，CKs在不同月份的睾丸中的表达定位不同。在9月份的睾丸中（图2A-2C），精子发生处于活跃期，CK-S在曲细精管上皮细胞中广泛大量表达，而CK-B只是微量表达；CKM的表达主要在精原细胞和初级精母细胞。在12月份的睾丸中（图2D-2F），精子发生基本处于停滞阶段，CK-B主要在精原细胞内表达；而CK-M的表达主要集中在精原细胞内及胞外，同时在管腔中也有表达；值得注意的是，CK-S的表达虽具有广泛性，但是在充满精子的管腔中表达量很高。在3月的睾丸中（图2G-2I），3种CK亚型的表达方式和12月份相似，但是管腔内的精子数量显著减少。因此，CK亚型在不同月份中也表现出不同的表达方式。CK-B和CK-M在冬眠后主要在精原细胞中表达，而CKM和CK-S在胞外和曲细精管管腔中也大量表达。

图2不同CK亚型在曲细精管中的表达定位分析。A-C，在9月份CK-M和CK-S在曲细精管中广泛大量表达；D-F，在12月份的精母细胞中三种亚型的CK均大量表达，在曲细精管的管腔中可见大量正在变形的精子（红色圆圈内）；G-I，3月份的曲细精管上皮细胞，三种CK亚型的表达方式和12月份相似；S，精原细胞；PS，初级精母细胞；SS，次级精母细胞；Sd，精子细胞；Sz，精子）；比例尺，25μmFig. 2 Localization and tissue expression analysis of CKs. A to C, in September, CK-M & S were extensively expressed in the seminiferous tubule; D to F, in December, all three CKs were extensively expressed in spermatocyte cells, and many metamorphic sperm cells were observed (marked by the red circle); G to I, in March, the patterns of CKs expression were similar to December; S, spermatogonia; PS, primary spermatocytes; SS, secondary spermatocyte; Sd, spermartid; Sz, spermatozoon; scale bar, 25μm

讨 论

在中华鳖冬眠前的9月份，生精上皮的精子发生非常活跃，曲细精管内可见大量发育中的精子呈“穗状”排列。而到了冬眠期，精子发生趋于静止，不仅“穗状”排列的精子消失，曲细精管内也鲜有精母细胞存在。但是冬眠期的精子发生并不是完全停止的—12月份的曲细精管内含有大量的精子，生精上皮内还存在处于变形阶段的精子；而到了3月份，曲细精管内仅有少量的精子存在，且处于变形阶段的精子几乎看不到。因此，中华鳖冬眠后精子的发生并不是完全停止的。虽然这与Zhang等[12]所描述的不完全一致，但是冬眠期精子的发生还是趋于静止的状态，精母细胞的数量也变得稀少。

关于中华鳖精子释放的方式，通常认为是在冬眠前一次性排放到附睾中。但是，我们观察到从12月份到来年的3月份，不仅仅是发育中的精子数量在减少，曲细精管内游离的精子数量也在减少。如果说精子的释放每年只有一次，那么就不会出现精子数量减少的情况。根据这个现象，我们推测精子的释放方式可能是一年多次的，即使是处于冬眠阶段。

能量代谢关键基因CKs的免疫组化结果显示，CKs在生精上皮中广泛和大量表达，且不同亚型的

[1] Bian X, Gandahi JA, Liu Y, et al.The ultrastructural characteristics of the spermatozoa stored in the caudaepididymidis in Chinese soft-shelled turtle Pelodiscussinensis during the breeding season. Micron, 2013, 44(1): 202-209.

[2] 刘海丽，胡冰，包慧君，等．雌性中华鳖输卵管精子储存结构的研究．畜牧与兽医，2010，42（7）：12-17．

[3] 毛伟平，王昭贤. 中华鳖睾丸、附睾结构和血浆睾酮水平的季节性变化. 南京师大学报：自然科学版，1997，2（2）：53-57.

[4] Brancaccio P, Maffulli N, Limongelli FM. Creatine kinase monitoring in sport medicine. Br Med Bull, 2007, 81-82(1):209-230.

[5] Kuiper JW, Pluk H, Oerlemans F, et al. Creatine kinase-mediated ATP supply fuels actin-based events in phagocytosis.PLoS Biol, 2008, 6(3): e51.

[6] MougiosV. Reference intervals for serum creatine kinase in athletes. Br J Sports Med, 2007, 41(41): 674-678.

[7] Teixeira PC, Santos RH, Fiorelli AI, et al. Selective decrease CK存在表达差异性。在冬眠前的9月份，CKs靠近卵原细胞的基膜内大量表达，而冬眠后仅仅少量表达；同时，在冬眠前的精子细胞和精子中，主要表达的亚型是CK-M和CK-S。CKs在曲细精管生精上皮中大量表达，可能在精子发生中发挥了重要的作用。of components of the creatine kinase system and ATP synthase complex in chronic Chagas disease cardiomyopathy.PLoS Negl Trop Dis, 2011, 5(6): e1205.

[8] YanYB.Creatine kinase in cell cycle regulation and cancer.Amino Acids, 2016, 48(8): 1775-1784.

[9] SafariS, Youse fi fardM, HashemiB, et al. The value of serum creatine kinase in predicting the risk of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury:a systematic review and meta-analysis. Clin Exp Nephrol, 2016, 20(2): 153-161.

[10] Jama N, Maphosa V, Hoffman LC, et al. Effect of sex and time to slaughter (transportation and lairage duration) on the levels of cortisol, creatine kinase and subsequent relationship with pork quality. Meat Sci, 2016, 116(1): 43-49.

[11] 罗比，王萍，李晓梅.不育男性、少精子症病人精子肌酸激酶活性及其同工酶组成的研究. 中国男科学杂志，2001，15（1）：33-36.

[12] Zhang L, Han XK, Qi YY, et al. Seasonal effects on apoptosis and proliferation of germ cells in the testes of the Chinese soft-shelled turtle, Pelodiscussinensis.Theriogenology, 2008, 69(9): 1148-1158.