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白藜芦醇通过抑制自噬相关蛋白LC3 I/II和beclin-1表达促进H2O2处理的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

2018-04-03俞晨张俊强曹威王高远汪陶荣殷瞳昕陈晓宇

关键词:低浓度白藜芦醇滑膜

俞晨,张俊强,曹威,王高远,汪陶荣 ,殷瞳昕,陈晓宇*

(1皖西卫生职业学院护理学系,六安 237000;2安徽医科大学组织学与胚胎学教研室,3安徽医科大学第一附属医院骨科,合肥 230022)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是慢性关节滑膜炎症,表现为慢性、系统性和破坏性的自身免疫性关节疾病。RA患者表现为成纤维样滑膜细胞( fi broblast- like synoviocytes,FLS)类肿瘤样生长致关节局部结构破坏[1]。研究证实[2],RA患者机体存在的氧化应激状态,且促进滑膜组织增生。白藜芦醇(resveratrol,Res)是从葡萄、虎杖等植物中提取的多元酚类植物抗毒素,具有抗炎、抗氧化、抗老化和预防肿瘤的特性[3]。本研究旨在进一步探讨Res对RA患者的抗氧化作用以及自噬在其中的影响。

材料与方法

1 试剂和主要仪器

白藜芦醇(纯度≥99%,美国Aladdin公司);30%H2O2(北京万佳首化生物科技有限公司);CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒(日本同仁化学公司产品);DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白试剂定量盒(美国Pierce公司);兔抗人LC3 I/II和兔抗人beclin-1(美国abcam公司);TUNEL染液、青链霉素溶液、蛋白预染Maker、一抗稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG和ECL化学发光液(碧云天生物有限公司);硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜(美国Millipore公司);半干转膜仪(大连竞迈生物科技有限公司);多功能酶标仪(美国Thermo公司)。

2 MDA、SOD和GSH-Px分光光度计检测

抽取住院RA患者空腹静脉血,离心后置于-20℃冰箱中保存待测。按照说明书操作程序进行MDA含量硫代巴比妥酸法、SOD活性羟胺法和GSH-Px活性比色法检测,进行。同时,取同期门诊健康体检正常人血清作为对照,RA患者和正常人一般情况,包括年龄、性别等差异无显著性,两组具有可比性。实验过程患者和健康体检者知情同意。

3 滑膜细胞的分离培养

采取组织块培养法,参照文献[4]并改进。RA患者膝关节镜无菌下取出的滑膜组织,剪成约1mm3大小碎块,含10%FBS的Ⅱ型胶原酶消化约2h;0.25%的胰蛋白酶消化,将细胞重悬于含15% FBS的DMEM培养液, 吹打均匀接种于培养皿中,37℃、5%CO2培养箱内培养,3~4d换液1次。待细胞长至≥70%时,进行传代培养。实验所用细胞为第3~5代。

4 细胞增殖的CCK-8法检测

将RA-FLS接种于96孔板中,每孔加入100µl细胞数为2.0×103个,每组设4复孔,次日细胞贴壁后加药处理。设不同浓度的H2O2处理组(0、1、5、10、20、40、80、100μmol/L)预先处理FLS 24h后,每孔加入10μl CCK-8工作液,继续在培养箱中培养4h。酶标仪测定在450nm处吸光度A值。

5 RA-FLS凋亡的TUNEL法检测

严格按照操作说明书,采用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)凋亡检测试剂盒检测FLS的凋亡情况。将RA-FLS接种于6孔板中,转移至玻片,培养24h,孵育5 µmol/L H2O212h,Res孵育24h,PBS洗10min×3遍,并用反应缓冲液37°C 下暗室中孵育30min。苏木精复染显示细胞核,凋亡细胞被染成棕色。

6 自噬相关蛋白的Western blot检测

将对数生长期RA-FLS按照2×105/孔细胞接种于6孔板,待细胞生长密度约80%时,如上加药处理24h后,用RIPA裂解液提取总蛋白,4℃、12000r/min离心5min;取上清液,BCA蛋白试剂盒蛋白定量,SDS-PAGE电泳(分离胶10% , 浓缩胶5%),半干转膜仪转膜1h,5%脱脂奶粉室温封闭2h,4℃孵育LC3I/II、beclin-1抗体过夜,TBST洗膜10min×3次,二抗室温孵育2h,TBST洗膜10min×3次,ECL化学发光,曝光压片,显影、定影。

7 统计学处理

结 果

1 白藜芦醇抑制RA患者血清中MDA含量增加与SOD和GSH-Px活性降低

与正常健康体检者比较,RA患者血清中MDA含量明显升高,SOD和GSH-Px活性显著降低,差异有显著性(表1),即RA患者氧化应激增强。

表1 RA患者血清MDA含量与SOD和GSH-Px活性Tab. 1 Serum MDA levels and the activities of SOD and GSH-Px in RA patients

2 H2O2对RA-FLS细胞增殖的影响

CCK-8法检测RA-FLS细胞增殖情况显示,给予不同浓度的H2O2处理24h后(将以0μmol/L H2O2处理的对照组细胞活力设为100%),1~5μmol/L H2O2可促进RA-FLS细胞增殖,当H2O2浓度继续升高,RA-FLS细胞增殖活力逐渐降低,当H2O2浓度达100μmol/L,RA-FLS细胞活力几乎为零(图1)。故在体外实验中,我们选择低浓度(5μmol/L)H2O2作为刺激RA-FLS细胞生长浓度。

图1 H2O2对RA-FLS细胞增殖的影响(n=5)Fig.1 Effect of H2O2 on RA-FLS proliferation(n=5)

3 白藜芦醇诱导低浓度H2O2处理的RA-FLS凋亡

TUNEL法检测不同浓度Res(0、5、20、50、100 μmol/L)对经低浓度(5μmol/L)H2O2处理的RA-FLS凋亡显示,0μmol/L Res处理未见明显FRAFLS凋亡现象;随着Res浓度的升高,FLS凋亡呈增加趋势(图2)。

图2 白藜芦醇诱导低浓度H2O2处理的RA-FLS凋亡(TUNEL染色)。A,0μmol/L Res;B,5μmol/L Res;C,20μmol/L Res; D,50μmol/L Res; E,100μmol/L Res;F,200μmol/L Res;比例尺,50μmFig. 2 Resveratrol induces the apoptosis of RA-FLS treated with 5μmol/L H2O2. A, 0μmol/L Res; B, 5μmol/L Res; C, 20μmol/L Res; D, 50μmol/L Res;E, 100μmol/L Res; F, 200μmol/L Res; scale bar, 50μm

4 白藜芦醇对自噬蛋白Beclin-1和LC3I/II表达的影响

Western blot检测不同浓度 Res(0、5、20、50μmol/L)对经5μmol/L H2O2处理的RA-FLS自噬相关蛋白表达的影响显示,与0μmol/L Res处理的对照组比较,随着Res浓度(5、20、50μmol/L)上升,自噬蛋白beclin-1和LC3 I/II的表达量逐渐降低。

讨 论

类风湿关节炎的发病中氧化应激性反应是一个重要因素,RA患者由于长期关节疼痛、功能受限、治疗等,机体常常处于应激状态,导致机体脂质过氧化反应,增加活性氧自由基( reactive oxygen species,ROS)[5]。生物膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的浓度高低表示组织细胞受ROS氧化损伤程度,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)是机体重要的抗ROS损伤酶类,保护生物膜结构和功能的完整性[6]。本研究表明,与正常健康对照者比较,RA患者存在血清MDA的浓度下降,GSHPx和SOD活性升高现象,进一步证实RA患者体内存在氧化应激状态。

图3 白藜芦醇对低浓度H2O2处理的RA-FLS内Beclin-1和LC3I/II表达的影响Fig. 3 Effect of Resveratrol on the expression of Beclin-1 and LC3I/II in RA-FLS treated with 5μmol/L H2O2

RA患者的主要特征为滑膜增厚,其中成纤维样滑膜细胞(FLS)、炎细胞(包括淋巴细胞和巨噬细胞)形成血管翳,形成渗透物浸润破坏局部的关节结构,FLS在RA发病过程中至关重要[7]。另外炎细胞和FLS可产生促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等,刺激活化的巨噬细胞和中性粒细胞分泌ROS,损伤关节结构[8]。为探讨RA患者机体氧化应激对FLS生长的影响,我们采用组织块和胶原酶消化作用,体外培养RA-FLS;然后用CCK-8法,检测不同浓度的H2O2对FLS增殖的影响,研究发现,低浓度(1~5μmol/L) H2O2可促进FLS细胞增殖,当H2O2浓度继续升高,FLS增殖活力逐渐下降,故在体外实验中以H2O2(5μmol/L)作为刺激FLS细胞生长浓度。我们前期研究已证实[3,4],在RA的常用动物模型佐剂性关节炎(AA)大鼠模型组中存在氧化应激,白藜芦醇(Res)可以降低AA大鼠氧化应激。本研究通过TUNEL法检测不同浓度Res对低浓度H2O2处理RA-FLS细胞凋亡的影响,结果表明,RA-FLS凋亡随着Res浓度的升高而增加。

ROS在诱导细胞自噬方面起重要作用,通过氧化调节自噬转录因子,进而调节自噬蛋白[9]。有研究发现[10],正常条件下,自噬相关蛋白beclin-1与凋亡相关蛋白Bcl-2 或Bcl-XL相互结合,导致beclin-1形成吞噬泡,在LC3 I/II作用下延长包绕线粒体并发育成熟,然后与溶酶体结合,引发线粒体自噬。为了解Res引起RA-FLS细胞凋亡的机制,我们研究了自噬相关的标志物LC3 I/II和beclin-1蛋白的表达变化。结果显示Res处理24h后,随着Res浓度增加而自噬作用减弱。因此,RA-FLS凋亡可能是由氧化应激和自噬通路蛋白表达下降引起ROS的积累,过多的ROS引起FLS细胞的凋亡。

综上所述,RA患者机体存在脂质过氧化,一定范围的过氧化会引起RA-FLS异常增殖,Res对RAFLS的异常增生的抑制作用,诱导FLS凋亡,其机制可能与氧化应激和自噬通路蛋白表达下降有关。

[1] Mateen S, Moin S, Khan AQ, et al. Increased reactive oxygen species formation andoxidative stress inrheumatoid arthritis. PLoS One, 2016, 11(4): e0152925.

[2] Khojah HM, Ahmed S, Abdel-Rahman MS, et al. Reactive oxygen and nitrogen species in patients withrheumatoid arthritisas potential biomarkers for disease activity and the role of antioxidants. Free Radic Biol Med, 2016, 97: 285-291.

[3] ZhangJ, Song X, Cao W, et al. Autophagy and mitochondrial dysfunction in adjuvant-arthritisrats treatment with resveratrol. Sci Rep, 2016, 6: 32928.

[4] 俞晨,张俊强,储海峰,等.白藜芦醇对过氧化氢诱导滑膜细胞凋亡的作用及 机制. 解剖学杂志,2016,39(4):431-435.

[5] Lee JY, Choi JK, Jeong NH, et al. Anti-in fl ammatory effects of ursolic acid-3-acetate on human synovial fi broblasts and a murine model ofrheumatoid arthritis. Int Immuno pharmacol, 2017, 49: 118-125.

[6] 苏会萍,张俊强,曹威,等. MnSOD-SIRT3在佐剂性关节炎大鼠肝组织中的表达和意义. 安徽医科大学学报,2016,51(9):1268-1272.

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