王齐，刘梅梅，雷娜，陈晓宇，戴寒晶，杨珺(安徽医学高等专科学校生物化学教研室，合肥 3060; 安徽医科大学组胚教研室，合肥3003）

缺血性卒中约占脑卒中疾病总数的70%，是由于大脑血供障碍而引发的缺血、缺氧，导致局限性脑缺血性坏死及软化的一种疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特征。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbeneglucoside，TSG）是何首乌中特有的水溶性生物活性成分，具有抑制粥样硬化、防治老年性痴呆、清除自由基抗氧化、抗肿瘤、保护脑组织等多种功能[1-5]。但是，TSG 对沙鼠I/R 后抑制神经元凋亡的机制尚未完全明了。本实验拟通过建立沙鼠全脑I/R模型，研究不同低浓度TSG对神经元迟发性凋亡相关因子p53、Bcl-2、Bax等表达的影响，以探讨TSG对于I/R引发神经元凋亡所起干预作用的可能机制。

材料与方法

1 实验动物、分组及造模

雄性蒙古沙鼠，体重70～90g，由安徽医科大学实验动物中心提供。25℃室温饲养，自由进食摄水，术前12h不禁水禁食。将42只实验蒙古沙鼠随机分成假手术组（Sham）、脑I/R模型对照组（I/R）、TSG小剂量（1.5mg/kg）组（I/R+TSGs）、TSG中剂量（3mg/kg）组（I/R+TSGm）、TSG大剂量（6mg/kg）组（I/R+TSGl）（根据课题组前期研究确定的剂量），依达拉奉（edaravone, Eda）（3mg/kg）阳性药对照组（I/R+Eda）。实验开始前30min，TSG给药组腹腔注射给药，两侧颈总动脉结扎再灌30min后再给药一次，连续6d，每天均给药一次。Sham组和I/R组均给予等剂量的生理盐水。第6d，颈椎脱臼法处死实验沙鼠，开颅取脑，将海马CA1区剥离[6]，放入液氮中迅速冷冻后，-80℃保存，用于海马CA1区Bcl-2和Bax的含量测定；脑组织行HE染色观察形态学改变及行免疫组织化学检测p53表达水平。

2 药品与试剂

TSG购于中国食品药品检定研究院，依达拉奉注射液购于吉林省博大制药有限责任公司，兔抗p53、兔抗Bcl-2和兔抗Bax抗体购于Abcam公司，兔抗GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司，兔SP免疫组组织化学试剂盒购于中杉金桥公司，Western blot超敏发光液购于普利莱基因技术有限公司。

3 SP法免疫组织化学染色检测p53表达

各实验组沙鼠麻醉后，取脑，将各实验组沙鼠脑组织多聚甲醛溶液固定，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片厚度5μm，脱腊水化后微波法进行抗原修复，3%过氧化氢去离子水孵育消除内源性过氧化酶活性，滴加正常山羊血清封闭液后再滴加p53一抗（1:100），4℃过夜，次日滴加生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育15min后再滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育15min后DAB显色，苏木精复染后脱水封片。在光学显微镜下观察，染成棕色的为阳性细胞。每个标本取3张切片，在光学显微镜（40×物镜）下观察，20倍物镜下计数5个不重复视野中染成棕色的阳性细胞数，得出其平均数作为本组代表值。

4 Western blot检测Bax和Bcl-2表达

沙鼠海马CA1区组织加入含有RIPA裂解液中裂解后，以转速12000r/min离心10min，提取上清液后测定样品蛋白，取蛋白40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭后分别加入Bax和Bcl-2一抗，4℃过夜，洗膜后加入二抗室温孵育1h，超敏发光液法曝光、X光片显影。用凝胶图象处理系统进行分析计算光密度值，以GAPDH作为内参。

5 统计学处理

结 果

1 TSG减轻脑缺血再灌注损伤

Sham组神经元排列整齐，核大，居中，胞膜清晰，细胞未见病理性改变。与Sham组相比，I/R组脑组织间质水肿较为明显，核固缩深染、神经元数目明显减少。与I/R组相比，各TSG处理组和阳性对照组神经元数量均有增多，细胞结构较完整，间质水肿减轻（图1）。

2 TSG降低脑缺血再灌注损伤对脑组织中p53免疫组织化学表达的上调

免疫组织化学染色检测显示，Sham组偶见p53阳性细胞，I/R组可见大量p53阳性细胞，TSG 中、高剂量组及阳性药对照组的p53阳性细胞数量较I/R组显著降低，表明TSG可减少I/R 损伤后神经元p53免疫组织化学表达的上调，但TSG低剂量组仍可见数量较多的p53阳性细胞，表明低剂量的TSG对I/R损伤后神经元p53表达上调的抑制作用不明显（图2）。

3 TSG抑制缺血再灌注损伤对海马CA1区Bax表达水平的上调

Western blot检测显示，相比较Sham组，I/R组沙鼠海马CA1区组织中Bax水平显著增高，TSG中、高剂量组和阳性药对照组均显著抑制I/R所引发的Bax水平上调（图3）。

图1 TSG对沙鼠脑组织I/R损伤影响的HE染色观察。A，Sham组；B，I/R组；C，I/R +TSGs组；D，I/R+TSGm组；E，I/R +TSGl组；F，I/R+Eda组；比例尺，50µmFig.1 The effect of TSG on the brain tissue of I/R gerbils was evaluated by HE staining. A, sham group; B, I/R group; C, I/R+ TSGs group; D, I/R+TSGm group; E, I/R+TSGl group; F, I/R+ Eda group; scale bar, 50µm

图2 TSG对沙鼠I/R损伤后脑组织中p53免疫组织化学表达的影响。A，假手术组；B，I/R模型对照组；C，I/R模型+TSG小剂量组；D，I/R模型+TSG中剂量组；E，I/R模型+TSG高剂量组；F，I/R模型+阳性药对照组；比例尺，50µm；G，p53免疫反应性的统计学分析；*，与Sham组比较，P＜0.01；#，与I/R组比较，P＜0.01Fig.2 The effect of TSG on p53 expression in the brain tissue of I/R gerbils was evaluated by immunohistochemistry. A, sham group; B, I/R group; C,I/R+TSGs group; D, I/R+ TSGm group; E, I/R+ TSGl group; F, I/R+ edaravone group; scale bar, 50µm; G, statistical analysis for p53 immunoreactivity;*, P＜0.01 vs Sham group; #, P＜0.01 vs I/R group

图3 TSG对沙鼠I/R损伤后海马Bax表达的影响。A，代表性Western blot检测；B，Bax水平的统计学分析；*，与Sham组比较，P＜0.01；#，与I/R组比较，P＜0.01Fig.3 Effect of TSG on Bax expression in the hippocampal of I/R gerbils.A, representative images of Western blot; B, statistical analysis for Bax expression. * P＜0.01 vs Sham group; # P＜0.01 vs I/R group

4 TSG抑制缺血再灌注损伤对海马CA1区Bcl-2表达水平的下调

Western blot检测显示，I/R组沙鼠海马CA1区组织中Bcl-2水平明显低于Sham组，TSG 中、高剂量组和阳性药对照组Bcl-2水平显著高于I/R组（图4）。

图4 TSG对沙鼠I/R损伤后海马Bcl-2表达的影响。A，代表性Western blot检测；B，Bcl-2水平的统计学分析；*，与Sham组比较，P＜0.01；#，与I/R组比较，P＜0.01Fig. 4 Effect of TSG on Bcl-2 expression in the hippocampal of I/R gerbils. A, representative images of Western blot; B, statistical analysis for Bcl-2 expression; *, P＜0.01 vs Sham group; #, P＜0.01 vs I/R group

讨 论

脑缺血/再灌注损伤的病理生理变化是一个涉及多方面因素的复杂过程，如产生了大量的氧自由基、细胞内Ca2+超载、细胞能量障碍、兴奋性氨基酸释放增加等［7］，通过启动凋亡相关蛋白表达并诱导凋亡信号转导通路，从而导致神经元的凋亡或坏死［8］。我们的前期研究发现，TSG对脑缺血/再灌注引发的脑损伤，尤其是海马区神经元迟发性凋亡，具有显著的治疗作用，而这种治疗作用与其抑制caspase-3蛋白的表达相关［4］,而TSG对I/R引发脑神经元损伤的保护作用是否还有其他可能的机制鲜有报道。细胞凋亡的相关调控基因研究表明，抑制与促进细胞凋亡最重要的两个基因是Bcl-2和p53[9]，而Bcl-2与Bcl-2家族成员Bax关系密切，Bax和Bcl-2的比率可能决定细胞生死趋势，另外Bax也是受P53调控的下游基因。因此，探讨p53、Bcl-2与Bax基因在脑缺血性损伤神经细胞中的表达是神经细胞死亡调控机制过程中的一个关键性环节，有助于神经细胞保护措施的研究。

在发生缺血性脑损伤时，被激活的核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）可上调多种促凋亡基因，从而加速神经元凋亡［10］，p53是其调控的凋亡蛋白中的重要成员之一[11]，在神经元凋亡过程中发挥着极其关键的作用。敲除p53或特异性抑制p53的小鼠在缺血性脑损伤时引发的神经元凋亡明显减少，有效减轻缺血性脑组织损伤[12]。Park等［13］研究发现局灶性缺血性脑损伤前1d给予基因调节剂（氧化偶氮甲烷）可明显减少脑梗死的体积，可能是因为氧化偶氮甲烷抑制了p53的活化，从而减轻缺血性脑损伤半暗区神经元的凋亡。Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，其高表达可阻止多种凋亡因素导致的细胞凋亡，而Bax具有促进细胞凋亡的能力，故Bcl-2和Bax对于细胞凋亡发挥着重要作用[14-17]。以往研究表明，p53从细胞质转运到线粒体诱导线粒体细胞色素C释放，激活Caspase-9引起细胞凋亡[18]，p53能上调Bax并下调Bcl-2[19]，而脑缺血组织中Bcl-2的表达升高可以调节线粒体膜上钙离子的内流，维持线粒体膜的完整性及调控氧化应激反应，从而改善细胞凋亡。李杨等[20]研究发现褪黑素干预后，可升高新生大鼠缺血缺氧损伤后海马的Bcl-2表达水平，降低Bax表达水平，从而抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用。Amemiya Sliw等[21]发现脑缺血时自由基清除药可通过调节Bcl-2和Bax的抗调亡机制来发挥神经保护作用。本实验研究发现，I/R组脑组织p53蛋白表达明显增加，而TSG 中、高剂量组及阳性对照组的p53蛋白表达较I/R组显著减弱； I/R组海马CA1区Bax蛋白显著活化，而Bcl-2蛋白表达显著降低，TSG中、高（3、6mg/kg）剂量组均可以显著诱导Bcl-2的表达，抑制Bax的活化。我们推测TSG可能通过抑制p53来上调Bcl-2下调Bax,以调节线粒体膜上钙离子的内流，维持线粒体膜的完整性及调控氧化应激反应，从而改善神经细胞凋亡来发挥神经保护的作用。

课题组前期研究发现TSG可对于脑缺血/再灌注引发脑神经元损伤有明显的保护作用，本实验通过建立沙鼠全脑缺血/再灌注模型，探讨TSG对缺血性脑神经元凋亡干预作用部分可能的机制，实验结果表明其作用机制可能与影响凋亡相关因子（p53、Bcl-2、Bax）的表达有关。

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